全麵揭秘衍生技術在液相色譜分析中的應用

Hello！小夥(huo) 伴們(men) 大家好，你是否在日常工作中遇到一些化合物難以用常規的實驗手段分析的情況，這時候我們(men) 應該怎麽(me) 辦呢？衍生是一種不錯的選擇方式，今天就跟小編一起來了解下衍生技術在液相色譜中的應用，看看她是如何幫我們(men) 克服難題的吧。

化學衍生法是指借助化學反應將待測組分接上某種特定基團，從(cong) 而改善其檢測靈敏度和分離效果的方法利用化學衍生反應達到改變化台物特性的目的，使其更適用於(yu) 特定分析的過程，在儀(yi) 器分析中被廣泛應用，如色譜（包括氣相 、液相 、超臨(lin) 界、薄層 、電泳和一些聯用技術等）、質譜 、核磁 、紫外一可見 、熒光和電化學分析等。

氣相色譜中應用化學衍生反應是為(wei) 了增加樣品的揮發度或提高檢測靈敏度，而高效液相色譜和毛細管電泳的化學衍生法是指在一定條件下利用某種試劑（通稱化學衍生試劑或標記試劑）與(yu) 樣品組份進行化學反應，反應的產(chan) 物有助於(yu) 色譜檢測或分離。

液相色譜衍生化技術是色譜分析中常用的輔助手段。衍生技術可以解決(jue) 目標物保留性差、不穩定、常規檢測方法不能直接檢測或檢測靈敏度比較低等問題。液相色譜儀(yi) 的衍生技術是指將待測物與(yu) 某種試劑即我們(men) 通常稱的衍生試劑反應，使之生成易於(yu) 檢測的化合物的過程。衍生化反應從(cong) 是否形成共價(jia) 鍵來說，可分為(wei) 兩(liang) 種：標記和非標記反應。標記反應是在反應過程中，被分析物與(yu) 標記試劑之間生成共價(jia) 鍵。所有其它類型的反應，如形成離子對、光解、氧化還原、電化學反應等都是非標記反應。

另一種區分衍生化反應是從(cong) 衍生反應的場所來分，有柱前衍生化 (pre-column derivatization)，柱上衍生化 (on-column derivatization)和柱後衍生化 (post-column derivatization)三種。

從(cong) 是否與(yu) 儀(yi) 器聯機的角度來分有：在線 (on-line)、離線(of-line)和旁線 (at—line)(自動化)三種。

使用意大利HT4000A自動樣品處理工作站，可完成複雜的多重自動化衍生操作，如下圖所示，不同品牌液相搭配HT4000A自動樣品處理工作站均可實現離線、在線或旁線衍生。

目前在 HPLC中以離線的柱前衍生法（簡稱柱前衍生法）與(yu) 在線的柱後衍生法（簡稱柱後衍生法）使用居多。旁線衍生法常用的反應有酯化、酰化、烷基化、矽烷化、硼wan化、環化和離子化和光化學反應等。

HT4000A衍生——渦旋混合

接下來我們(men) 一起來看看衍生的不同方式

第一種方式將被測物轉變成可檢測的衍生物後，再通過色譜柱分離。即將被測物和衍生試劑分別通過兩(liang) 個(ge) 或多個(ge) 輸液泵送到反應器裏混合，並使之立即反應完成，隨之進入色譜柱，這就是在線柱前衍生了；

也可以先將被測物和衍生試劑反應，再將衍生物作為(wei) 樣品進樣，進行色譜分析，此時該方法為(wei) 離線柱前衍生；有的文獻中提到也可以在流動相中加入衍生試劑，進樣後，讓被測物與(yu) 流動相直接發生衍生反應這樣就是在線衍生。

柱後衍生是指先將被測物分離，再將從(cong) 色譜柱流出的溶液與(yu) 衍生試劑在線混合，生成可檢測的衍生物，然後導入檢測器。按生成衍生物的類型可分為(wei) 紫外可見光衍生、熒光衍生、拉曼衍生和電化學衍生和光化學衍生等。

氨基酸柱後/柱前衍生示意圖

1、紫外可見光衍生：

1）紫外衍生是指將紫外吸收弱或無紫外吸收的有機化合物與(yu) 帶有紫外吸收基團的衍生試劑反應，使之生成可以用紫外檢測的化合物。如胺類化合物容易與(yu) 鹵代烴、羰基、酰基類衍生試劑反應。

2）可見光衍生有兩(liang) 個(ge) 主要的應用：一是用於(yu) 過渡金屬離子的檢測，將過渡金屬離子與(yu) 顯色劑反應，生成有色的配合物、螯合物或離子締合物後用可見光檢測；二是用於(yu) 有機離子的檢測，在流動相中加入被測離子的反離子，使之形成有色的離子對化合物後，分離檢測。

2、熒光衍生：

熒光衍生是指將被測物與(yu) 熒光衍生試劑反應後生成具有熒光的物質進行檢測。有的熒光衍生試劑本身沒有熒光，而其衍生物卻有很強的熒光。衍生技術不僅(jin) 使液相色譜儀(yi) 分析體(ti) 係複雜化，而且需要消耗時間，增加分析成本，有的衍生反應還需要控製嚴(yan) 格的反應條件。因此，隻有在找不到方便而靈敏的檢測方法或為(wei) 了提高分離檢測的選擇性時，才考慮用衍生技術。

3、光化學衍生：

光化學衍生（PhotoChemical Derivatization, PCD）分析法是基於(yu) 光化學反應而建立的一類分析方法，它以其du特的衍生方式與(yu) 傳(chuan) 統的熒光，化學發光，紫外-可見，電化學等檢測方法相結合，提高了原有方法的靈敏度與(yu) 選擇性，極大地拓展了傳(chuan) 統檢測方法的應用範圍，在藥物、複雜生物樣品，環境樣品分析測定等方麵得到廣泛應用。

柱後化學衍生反應主要以熒光分析為(wei) 主，也有以電化學檢測的分析方法。光化學反應的主要類別如下：分子內(nei) 能量轉移、碰撞能量轉移、淬滅、光致離子化、異構化、直接反應、分子間分解。

WelView光化學衍生器

AFT經柱後光化學衍生後，能發射特征性熒光，被熒光檢測器捕獲後而得到檢測，最後經色譜工作站處理數據。 光化學衍生搭配FLD檢測器可以有效的檢測低濃度的黃曲黴毒素，方法靈敏度遠高於(yu) 其他檢測方法。

光化學衍生器與(yu) HPLC聯用示意圖

色譜柱：月旭氨基酸分析柱 Amino Acid，5μm，4.6×250mm。