幹貨 | 固相萃取實驗成敗的影響因素、常見問題

固相萃取是一個(ge) 目標物在固定相上吸附、解吸附/洗脫的過程，因此影響吸附、解吸附、洗脫的因素都會(hui) 直接影響萃取的效率，如填料類型、洗脫溶劑的強度、pH、流速等。

填料是固相萃取技術的核心，選擇對目標物具有適中吸附性的 SPE柱填料是確保檢測準確的前提。當然針對同一種目標物，我們(men) 可以選擇不同的柱料，但是要注意方法的調整。

固相萃取是固定相-填料與(yu) 流動相-上樣溶劑/洗脫溶劑對目標物的競爭(zheng) 吸附作用，所以在上樣時，要選擇有機溶劑含量或pH都合適的上樣液，以避免目標物在上樣時漏掉。而在洗脫時，也必須選擇適合的溶劑強度，即有機溶劑的含量或pH，以確保能將吸附在填料上的目標物徹di洗脫下來。

對於(yu) 離子交換固定相，被分析成分與(yu) 幹擾物質的pKa(等電點)各不相同。通過調節溶劑pH的大小，可以使固定相帶電荷，被分析物帶相反電荷，而使幹擾物質不帶申荷：或使固定相帶申荷，幹擾物質帶相反申荷，而使被分析物不帶電荷。

上樣流速和洗脫流速會(hui) 影響吸附或解吸附/洗脫的效果，上樣和洗脫的流速一般控製在1mL/min以內(nei) 。對於(yu) 大量樣品痕量富集，如環境水樣中有機物的富集，上樣流速不超過5mL/min。除了以上的幾個(ge) 因素，一些操作步驟完成的情況，如活化的程度、淋洗步驟的抽幹等，也會(hui) 影響結果的回收率或重現。

1. 為(wei) 什麽(me) SPE小柱操作要強調流速？

答：大多數實驗人員都希望實驗做的又快又好，在固相萃取實驗中，往往偏好用比較快的流速過柱。這裏就必須要注意流速太快的弊端。因為(wei) SPE小柱的填料裝填壓實以後，形成柱床，當溶劑流過小柱，速度過快將導致兩(liang) 個(ge) 問題，一個(ge) 問題是對於(yu) 鍵合相填料，由於(yu) 流速快而使得其不能充分浸潤舒展，因而導致其保留活性降低；其次過快的流速導致小柱可能形成溝渠，使得填料未被充分浸潤，降低了吸附填料與(yu) 樣品的接觸麵積，影響了目標物質的傳(chuan) 質過程，因而導致回收率降低。

2. 溶劑環境的pH怎麽(me) 影響化合物在小柱上的保留？為(wei) 什麽(me) 我們(men) 要關(guan) 注化合物的pKa值？在C18小柱中需要考慮這些因素嗎？

答：首先我們(men) 來說一下，Ka指的是酸度係數，又名酸離解常數，可以理解為(wei) 酸離解H離子的能力，而pKa=-lgKa，對於(yu) 酸，在環境pH下存在如下平衡：

左邊的A-/HA，實際是指溶劑環境下，離子態和分子態的比例，右邊反映了左側(ce) 兩(liang) 者的轉化關(guan) 係，取決(jue) 於(yu) （pH-pKa)的數值大小。對於(yu) 離子交換小柱，保持目標物的離子化而非分子態，是一個(ge) 關(guan) 鍵點，這對於(yu) 離子交換作用機理的交換柱，將直接關(guan) 係到其實驗成敗。而對於(yu) 矽膠鍵合C18小柱的萃取，由於(yu) 矽膠（—SiOH）不能wan全“封端"，在pH大於(yu) 4.0的情況下，矽膠都會(hui) 帶上負電荷，因而會(hui) 使得能電離的化合物與(yu) 矽膠作用，增強了這種附帶的次級作用力（主作用力為(wei) 非極性相互作用力），而使得此類物質在矽膠-C18上的保留增強，若隻考慮C18的非極性作用力，必然會(hui) 導致回收結果不盡如人意。

3. 為(wei) 什麽(me) 在農(nong) 殘檢測過程中GCB常見於(yu) 淨化模式，而不用於(yu) 富集模式？

答：SPE的淨化模式常被用來吸附雜質，而富集模式常被用來吸附目標物質，GCB是一種石墨化碳黑，它由六個(ge) 碳原子構成平麵六角形，並且層疊而成，對於(yu) 芳香平麵分子，很容易嵌入，而具有較強吸附芳香化合物的選擇性，對於(yu) 其他分析物也有較好的吸附性能，填料的吸附與(yu) 解吸附的性能將直接影響填料的使用範圍，對於(yu) GCB而言，其吸附性能較強，但是解吸附的可逆性稍差，需要選擇合適強度的溶劑來釋放被吸附的物質，因而造成了解析溶劑匹配較為(wei) 困難，由於(yu) 其對色素等的優(you) 秀吸附性能，因而在農(nong) 殘樣品處理中，常用來吸附色素等雜質，而不是選擇用來保留目標化合物。

4. 淋洗步驟通常需要抽真空幹燥，這個(ge) 原因是什麽(me) ？

答：淋洗後通常要抽真空幹燥，主要作以下考量：

1）通常由於(yu) 反相萃取在化合物的前處理中使用的比較多，正如反相色譜在色譜中作為(wei) 常見的分離方法一樣，在反相萃取中的淋洗液常為(wei) 水相或者含水的緩衝(chong) 溶液，去除水份，可以便於(yu) 後續幹燥濃縮步驟。

2）有的項目，在淋洗步驟完成後，直接用一定體(ti) 積的洗脫液，比如1mL的甲醇洗脫，此過程將洗脫與(yu) 定容集為(wei) 一步處理，前一步的處理必然對洗脫步驟的定量結果產(chan) 生影響。

3）便是溶劑互溶問題，當淋洗步驟使用的溶劑極性與(yu) 洗脫溶劑的極性差異較大時，會(hui) 產(chan) 生乳化分層，洗脫阻力大，洗脫液被稀釋的風險等，導致洗脫效果的差異，以致於(yu) 實驗結果的失敗。

5. 我們(men) 在使用矽膠鍵合填料類型的色譜柱的時候，出於(yu) 對色譜學的常識，知道了矽膠鍵合填料一般廠商建議的pH使用範圍為(wei) 2-8，那麽(me) 對於(yu) 使用矽膠鍵合的填料的固相萃取小柱，是否需要嚴(yan) 格遵守這樣一條規定？

答：首先，我們(men) 需要了解到，廠家建議的pH2-8的耐受範圍，是為(wei) 了保證色譜柱的正常使用壽命，當pH值超出酸性範圍時，鍵合相易發生水解而流失；當pH超出堿性範圍時，會(hui) 加速矽膠的溶解。因此會(hui) 損害色譜柱柱效和保留特性，但是我們(men) 知道這個(ge) pH耐受值範圍外的溶劑對於(yu) 色譜柱的影響，主要是一個(ge) 積累性的過程，在溶劑衝(chong) 刷下，逐漸溶解而導致色譜柱性能改變和不可逆，壽命減短。SPE小柱和色譜柱的一個(ge) 差異就是，SPE是一次性消耗品，在耐受的溶劑範圍外，短暫時間的溶劑衝(chong) 刷對於(yu) 小柱的保留特性影響甚微，並不會(hui) 導致其保留顯著差異，因此其使用的pH範圍更寬，一般可以在pH值範圍1-10使用，而不會(hui) 導致其結果的差異性。