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021-50276769體(ti) 積排阻色譜法（SEC）又稱凝膠色譜法，通常用於(yu) 分子量大於(yu) 2000的樣品的分離。SEC方法zui廣泛的用途是測定聚合物的分子量分布，對某些大分子樣品如蛋白質、核酸等，也是種很有效的分離純化手段。SEC方法能簡便快速地分離樣品中分子量相差較大的組分，因而適合於(yu) 未知樣品的初步探索性分離，無需進行複雜實驗就能較為(wei) 全麵地了解樣品組成分布的概況。
體(ti) 積排阻色譜原理
分子的體(ti) 積排阻，樣品組分和固定相之間原則上不存在相互作用，色譜柱的固定相是具有不同孔徑的多孔凝膠，在固定相確定的分子量範圍內(nei) ，洗脫順序按照分子大小分布。當樣品分子量較大，以至於(yu) 被wan全排除在固定相微孔之外時（全排阻），其保留體(ti) 積等於(yu) 色譜柱內(nei) 微粒間的空隙體(ti) 積；而分子量足夠小的分子可以wan全進入微孔中，其保留體(ti) 積為(wei) 空隙體(ti) 積和固定相中微孔體(ti) 積之和，因此小的溶質分子保留時間長，洗脫體(ti) 積大，而大的溶質分子保留時間短，洗脫體(ti) 積小。固定相的分子量測定範圍即為(wei) 全滲透和全排阻之間的分子量範圍。
理想的體(ti) 積排阻色譜固定相應具有窄的孔徑分布範圍，而係列色譜固定相應具有寬範圍的孔徑分布，可根據樣品的不同選擇不同分子量範圍的SEC柱，也可將不同規格的SEC柱串聯使用，用於(yu) 分離更大分子量範圍的樣品。
體(ti) 積排阻色譜的分類
凝膠過濾色譜法-GFC
一般用於(yu) 分離水溶性的大分子，凝膠的代表是葡聚糖係列，洗脫溶劑主要是水。
凝膠滲透色譜法-GPC
主要用於(yu) 有機溶劑中可溶的高聚物相對分子質量分布分析及分離，常用的凝膠為(wei) 交聯聚苯乙烯凝膠，洗脫溶劑為(wei) 四氫呋喃等有機溶劑。
兩(liang) 種方法的分離原理雖然相同但采用的固定相、分離對象和使用技術wan全不同。
分類 | 凝膠過濾色譜 GFC | 凝膠滲透色譜 GPC |
固定相 | 低交聯度多孔聚合物 （在有機溶劑中會(hui) 溶脹） 如葡聚糖，瓊脂糖， 聚丙烯酰胺 | 交聯聚苯乙烯樹脂 （在有機溶劑中溶脹性較小）如聚乙烯-二苯乙烯共聚物 |
流動相 | 采用水溶液或緩衝(chong) 液 作為(wei) 流動相 | 有機溶劑，THF，DMF， 三氯ji烷等 |
應用對象 | 多肽生物大分子蛋白質， 纖維素衍生物， 聚乙烯醇多糖類 | 結晶合成聚合物， 小分子聚合物 |
優(you) 缺點 | 條件溫和， 分離機理簡單， 操作參數少， 耐高溫， 選擇性低 | 使用廣泛，滲透性好， 柱效高，不宜長期高溫 條件使用 |
體(ti) 積排阻色譜流動相的選擇
體(ti) 積排阻色譜法中，實際的分離效果與(yu) 樣品、流動相之間的相互作用無關(guan) ，因此改變流動相的組成一般不會(hui) 改變分離度。當采用示差折光檢測器時，為(wei) 提高檢測靈敏度，應使流動相的折射率與(yu) 被測樣品的折射率有盡可能大的差別。若使用紫外吸收檢測器，也應采用在檢測波長無紫外吸收的溶劑。
體(ti) 積排阻色譜法中流動相的選擇原則：
01
流動相對樣品應有足夠的溶解能力，黏度小，與(yu) 檢測器匹配。
02
流動相必須與(yu) 固定相匹配，能浸潤凝膠，如對苯乙烯二乙烯基本聚合物固定相選擇非極性流動相；多孔矽膠固定相應選擇極性強的流動相。
03
為(wei) 增加樣品溶解度而采用高柱溫操作時，應選用高沸點溶劑。
凝膠滲透色譜主要用於(yu) 高聚物分子量的測定。四氫呋喃對此類樣品有良好的溶解性能，可使小孔徑聚苯乙烯凝膠溶脹，因此被廣泛使用作為(wei) GPC流動相。但因其在儲(chu) 運過程中特別是在光照射條件下，容易生成過氧化物，使用前必須除去。二甲基甲酰胺、鄰二氯苯、間甲酚等溶劑可在高柱溫條件下使用；強極性的六氟異丙醇、三氟乙醇等可用於(yu) 粒度小於(yu) 10μm的凝膠柱。
在凝膠過濾色譜中，通常以具有不同pH值的緩衝(chong) 溶液作為(wei) 流動相。當采用親(qin) 水性有機凝膠（葡聚糖、瓊脂糖、聚丙烯酰胺等）、矽膠或改性矽膠為(wei) 固定相時，固定相與(yu) 樣品間可能存在多種相互作用影響GFC測定準確性，可在流動相中添加少量無機鹽以保持一定的離子強度（0.1~0.5mol/L），其中鈉、鉀、銨等的硫酸鹽、磷酸鹽消除吸附作用的效果較好。當使用矽膠基質凝膠時，流動相的pH值應保持在4~8的範圍，以免矽膠鍵合相被破壞。
月旭產(chan) 品介紹
月旭科技Xtimate® SEC填充劑采用du特的化學鍵合技術，在矽膠表麵鍵合親(qin) 水性聚合物以及親(qin) 水性二醇基團，雙重鍵合機製使水溶性高分子聚合物蛋白、生物酶、多肽等生物樣品的非特異性吸附極小，因而可廣泛應用於(yu) 水溶性聚合物及生物大分子的分離和測定。
固定相 | SEC- 120 | SEC- 300 | SEC- 500 | SEC- 700 | SEC- 1000 | SEC- 2000 |
填充劑 | 球狀親(qin) 水改性矽膠 | |||||
孔徑Å | 120 | 300 | 500 | 700 | 1000 | 2000 |
蛋白分子量範圍 | 500- 150000 | 5000- 1250000 | 10000- 3500000 | 15000- 5000000 | 50000- 7500000 | ＞10000000 |
水溶性高分子範圍 | 500- 25000 | 1000- 100000 | 2000- 500000 | 2500- 500000 | 5000- 1500000 | 50000- 2500000 |
pH | 2-7.5 | |||||
最大壓力（psi） | 4500 | 3500 | 3000 | 3000 | 3000 | 3000 |
色譜柱的異常衝(chong) 洗
多次使用後某些樣品可能會(hui) 吸附到入口篩板或填料上。當積累至一定程度時會(hui) 出現壓力升高並伴隨峰形展寬的異常現象，需要進行特殊的衝(chong) 洗。
該衝(chong) 洗的清洗溶液選擇的基本原則：
01
低pH的鹽溶液有助於(yu) 移除堿性蛋白（如0.5M硫酸鈉溶液，硫酸調整pH3.0）。
02
有機溶劑有助於(yu) 移除疏水蛋白，可以采用含有機溶劑（如10-20%的甲醇、乙腈、乙醇等）的緩衝(chong) 溶液（如50mM磷酸鹽緩衝(chong) 液，pH7.0）。
03
助溶劑有助於(yu) 去除在固定相上強吸附的物質（如通過氫鍵作用等）。
注意：隻有在中性鹽溶液或有機溶劑沒有明顯改善效果的情況下使用助溶劑（如：6-8M的尿素或0.2-0.3%十二烷基硫酸鈉）。
流速一般采用1/2做樣流速，柱長≤100mm，各項衝(chong) 洗60min；柱長＞100mm，各項衝(chong) 洗120min。
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