反相液相色譜峰拖尾問題，解決全過程！

反相色譜中，通常非極性和弱極性的化合物能獲得良好的峰形，而帶有-COOH、-NH2、-NHR、-NR2等極性基團的化合物則比較容易產(chan) 生拖尾。究其原因，是矽膠表麵殘留矽羥基對極性和堿性樣品分子產(chan) 生的次級保留效應（前提：排除色譜柱問題和樣品過載問題）。

峰形優(you) 化實例分析

-分析物的部分結構-

1、初始方法

以0.02mol/L庚烷磺酸鈉溶液（含0.5%三乙胺，用磷酸調節pH值至3.5）-甲醇（49∶51）為(wei) 流動相；檢測波長為(wei) 210nm；某未知品牌C18柱；初始結果：峰拖尾，峰寬5min，無法出尖峰。需要做方法優(you) 化，達到峰形對稱。

2、拖尾原因分析

反相填料表麵有殘餘(yu) 的矽羥基，具有一定的酸性，其pKa約為(wei) 4.5～4.7。根據電離規律，當流動相的pH-pKa>2即pH>6.7時，99％以上的矽羥基應是呈離子狀態的，即Si-O- 。

而當pKa-pH>2即pH<2.5時，酸性環境抑製了矽羥基的電離，99％以上的矽羥基應是呈分子狀態的，即Si-OH，但其極性仍然存在，為(wei) Si-Oδ-Hδ+。Si-Oδ-Hδ+和-Si-O-對於(yu) 極性化合物之間的作用力則是一種極性的靜電作用力，這種作用力比範德華力要強得多。

同時，因為(wei) 矽膠表麵鍵合了C18長鏈，由於(yu) 空間位阻作用，樣品分子能接觸到殘餘(yu) 矽羥基的機會(hui) 不多，隻有少部分的分子才能與(yu) 殘餘(yu) 矽羥基產(chan) 生強的靜電作用而被推遲洗脫出來，峰形拖尾。

3、優(you) 化方向

抑製矽膠上殘餘(yu) 矽羥基與(yu) 分析物之間的作用，減弱次級吸附作用。

● 減少矽膠上殘餘(yu) 矽羥基或減少與(yu) 分析物間發生作用的殘餘(yu) 矽羥基，占據矽羥基這個(ge) 作用位點。比如，使用徹di封端的色譜柱；在流動相中添加三乙胺（TEA）、四丁基硫酸氫銨等作為(wei) 減尾劑，競爭(zheng) 殘留矽羥基；調節流動相pH。

● 減少與(yu) 殘餘(yu) 矽羥基發生作用的分析物離子，占據-NH2、-NHR、-NR2這些分析物作用位點。比如，加入辛烷磺酸鈉等烷基磺酸鹽離子對試劑。

● 幹擾殘餘(yu) 矽羥基與(yu) 分析物間的相互作用。比如加入緩衝(chong) 鹽，增強流動相的離子強度。

4、優(you) 化過程

#01、選擇合適的高純矽膠徹di封端色譜柱：Blossmate® Polar RP（4.6*300mm，5μm）。

分析：峰拖尾，峰寬2min，優(you) 於(yu) 初始條件的結果。拖尾的嚴(yan) 重程度與(yu) 樣品分子極性大小和殘餘(yu) 矽羥基的多少有著直接的關(guan) 係。相同的樣品在不同品牌的柱子上產(chan) 生拖尾的嚴(yan) 重性不同。從(cong) 填料合成的角度而言就是：鍵合密度是否高、封尾是否徹di。高密鍵合和徹di的封尾能顯著減少靜電作用機會(hui) ，獲得良好的峰形。月旭科技Ultimate®係列XB-C18、AQ-C18、Blossmate®係列Polar RP和Xtimate®係列C18采取的就是高密鍵合和徹di的雙峰尾工藝。

#02、降低流動相pH：改為(wei) 2.5，後續一直使用Blossmate® Polar RP色譜柱。

分析：酸性環境抑製了矽羥基的電離，拖尾稍有改善，但不明顯，pH對峰形改善作用較小。

#03、水相添加磷酸二氫鉀，減小庚烷磺酸鈉濃度，流動相改為(wei) ：0.01mol/L庚烷磺酸鈉溶液（含50mmol/L磷酸二氫鉀，0.5%三乙胺，用磷酸調節pH值至2.5）-甲醇（49∶51）

分析：流動相中緩衝(chong) 鹽爆發出力挽狂瀾的氣勢，峰拖尾現象變成峰前延。

#04、恢複庚烷磺酸鈉濃度，流動相改為(wei) ：0.02mol/L庚烷磺酸鈉溶液（含50mmol/L磷酸二氫鉀，0.5%三乙胺，用磷酸調節pH值至2.5）-甲醇（49∶51）。

分析：峰拖尾，比不加磷酸鹽時峰形好。根據3和4的結果可以推斷：在0.01mol/L 至0.02mol/L之間範圍濃度的庚烷磺酸鈉溶液（含50mmol/L磷酸二氫鉀，0.5%三乙胺，用磷酸調節pH值至2.5）-甲醇（49∶51）可以使得峰形對稱。

#05、流動相改為(wei) ：0.015mol/L庚烷磺酸鈉溶液（含50mmol/L磷酸二氫鉀，0.5%三乙胺， pH 2.8）-甲醇（49∶51）。

分析：拖尾改善，峰形較好。可以看出，調整庚烷磺酸鈉濃度對峰形的改善作用較大。

#06、流動相改為(wei) ：0.015mol/L庚烷磺酸鈉溶液（0.5%三乙胺， pH2.9）-甲醇（49∶51）。

分析：峰拖尾。可以發現，在沒有磷酸二氫鉀存在的情況下，同時改變庚烷磺酸鈉和pH，與(yu) 1的結果比較，峰形雖有改善，不對稱由3.38變為(wei) 3.13，作用不大。流動相中磷酸二氫鉀的存在具有決(jue) 定性作用。

#07、主要通過調整流動相中庚烷磺酸鈉濃度來改善峰形，流動相改為(wei) ：0.0125mol/L庚烷磺酸鈉溶液（含50mmol/L磷酸二氫鉀，0.5%三乙胺， pH 3.1）-甲醇（49∶51）。

分析：峰前延。

#08、增加庚烷磺酸鈉濃度，流動相改為(wei) ：0.0138mol/L庚烷磺酸鈉溶液（含50mmol/L磷酸二氫鉀，0.5%三乙胺， pH3.14）-甲醇（49∶51）。

分析：峰拖尾因子1.24。後續隻需微調庚烷磺酸鈉濃度於(yu) 0.0125-0.0138mol/L（含50mmol/L磷酸二氫鉀，0.5%三乙胺，微調pH約至2.5），可進一步優(you) 化峰形。

#01、相同的樣品在不同品牌的柱子上產(chan) 生拖尾的嚴(yan) 重性不同，高密鍵合和徹di的封尾能顯著減少靜電作用機會(hui) ，獲得良好的峰形。

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#02、流動相中加入磺酸鹽離子對試劑能與(yu) 樣品分子作用，從(cong) 而阻止樣品分子與(yu) 殘留矽羥基發生次級吸附作用，進而改善峰形及增加保留。一般加入0.003-0.01mol/L濃度。

#03、流動相中加入緩衝(chong) 鹽，增強了流動相的離子強度，在-NH3+等極性基團和矽羥基Si-O-之間存在著許多離子的幹擾，減少了樣品分子與(yu) 矽羥基之間相互接觸的機會(hui) ，有助於(yu) 削弱極性基團與(yu) 矽羥基之間的相互作用，改善峰形。

#04、加入三乙胺作為(wei) 減尾劑改善峰形的時候，有兩(liang) 點需要注意：

● 三乙胺的堿性很強，加入三乙胺後流動相的pH可能超出色譜柱的使用範圍，對色譜柱造成損傷(shang) 。pH的改變也會(hui) 導致出峰時間的顯著變化，可能引起的其它問題，建議流動相中加入三乙胺後回調至未加入前的pH值。通常即使pH回調過後，由於(yu) 三乙胺成為(wei) 了固定相的一部分，保留時間也有較大變化；

● 三乙胺在210nm處有一定的吸收，如果液相方法中檢測波長在210nm以下測定時需要謹慎使用。四烷基季銨鹽（如四丁基硫酸氫銨、四丁基溴化銨、四丁基氫氧化銨等）在水中電離後，也形成了類似N+H(CH2CH3)3的結構N+(CH2CH2CH2CH3)4，這種結構也能有效的與(yu) Si-O-產(chan) 生較強的靜電作用，阻止氨基與(yu) 矽羥基的接觸，改善峰形。而且它還有一個(ge) 不同於(yu) 三乙胺的顯著特點是，在低波長範圍其紫外吸收比三乙胺弱，檢測波長在210nm以下測定時可選擇使用。

● 酸性化合物拖尾需要降低流動相的pH值，盡量使酸質子化；可以通過向流動相中加入競爭(zheng) 的有機酸得到較好結果，如使用0.1%三氟yi酸 (TFA) ，並且這種添加劑具有比較低的紫外截止波長。

參考資料：食品夥(huo) 伴網