色譜柱固定相鍵合方式及修飾方法有哪些？

日常工作中，經常遇到老師谘詢矽膠單體(ti) 表麵的矽烷鍵合方式，是單鍵鍵合、雙鍵鍵合還是三鍵鍵和呢？填料表麵是否有活性矽醇基，有沒有封端？碳鏈上是否嵌入極性官能團，是哪種官能團？在有些項目標準上，要求固定相是堿基失活矽膠。熟悉固定相鍵合方式及其修飾，有助於(yu) 了解色譜柱的使用條件，選擇合適的色譜柱。

製備反相色譜柱填料常用的方法是有機矽烷和矽膠表麵的矽醇基上發生共價(jia) 反應，來“鍵合"生成固定相或者配合基R：

X3-Si-R+≡Si-OH→≡Si-O-Si（X2）-R+HX

（矽烷）（矽烷醇）（最後的固定相）

HPLC柱子的製備可通過幾種不同的矽烷-矽膠反應來實現。單體(ti) 相是反相柱子裏使用zui廣泛的技術，即一個(ge) 矽烷分子和矽醇基反應。這種一對一鍵合，使生成的鍵合相相對完善並且具有很好的重現性。這樣製作的填料通常會(hui) 具有zui高的柱效，因為(wei) 固定相層相對不擁擠，因此溶質分子能夠快速擴散進出固定相。相反，多官能團的、高度聚合的固定相則表現出較低的溶質擴散速度和較低的柱效，尤其是在流動相流速較高的情況下。

目前單體(ti) 的矽烷-矽膠鍵合技術主要分為(wei) 四種：單鍵鍵合（Ultimate^® XB-C18）、雙鍵鍵合（Sunfire C18）、三鍵鍵合（Ultimate^® PAH）、雙齒鍵合（ZORBAX Extend C18）。單鍵鍵合有利於(yu) 提高傳(chuan) 質速率，加快色譜柱平衡，但在低pH條件下長期使用時，單鍵鍵合相易流失，在色譜圖上表現為(wei) 保留時間縮短。而使用多鍵鍵合的方式（雙鍵鍵合、三鍵鍵合和雙齒鍵合）可以提高固定相在低pH條件下的穩定性。

因為(wei) 存在結構位阻，矽膠表麵的矽醇基無法wan全與(yu) 矽烷分子鍵合，而殘留的矽醇基，可能與(yu) 堿性化合物發生次級離子交換作用，導致峰形不佳，因此常采用體(ti) 積較小的TMS（如三甲基矽烷）或者其他技術封端，使填料表麵盡可能的減小殘留矽醇基。但是TMS在pH較低時容易被水解和破壞，這會(hui) 造成保留時間和選擇性發生改變。另一方麵來說，封端填料提高了色譜柱在堿性條件下的穩定性，降低柱流失，並有利於(yu) 色譜柱對極性和堿性化合物的分離、提供良好的峰形。

在矽膠表麵的十八烷基的側(ce) 鏈上引入甲基、異丙基或異丁基，可以極大程度的屏蔽矽膠表麵矽醇基的作用。空間保護對於(yu) 低pH的分離實驗非常有幫助，避免了低pH條件下O-Si鍵的斷裂，但不能用在高pH條件下。具有空間保護功能的固定相可以以多種配合基的形式存在（比如，C8、C18、氰基、苯基），每個(ge) 配合基在流動相較低的pH條件下均能保持較高的穩定性（pH低至0.8）。常見該類型色譜柱如月旭Ultimate^® LP係列色譜柱。

一般反相色譜柱對強極性和強堿性物質分離較差，在反相固定相的碳鏈中嵌入極性基團（如脲基、酰胺基、醚基或甲酸酯基），提高對此類物質的選擇性，同時極性基團屏蔽了矽膠表麵的矽醇基作用，可極大改善峰形，在測定堿性物質時不拖尾。典型代表如采用酰胺基團的Ultimate^® Polar-RP色譜柱。

另外碳鏈中存在極性基團，能使固定相的親(qin) 水性濕潤性增強，用到95%以上的高水流動相時，不會(hui) 發生相塌陷。具有與(yu) 普通的反相C18和C8柱不同的選擇性，特別是對於(yu) 酚類等極性物質。