帶你了解親和色譜法

親(qin) 和色譜基於(yu) 生物分子固有的特異性相互作用進行樣品的高選擇性分離。特異性相互作用包括醇能與(yu) 底物、抑製物、輔酶等的結合；抗體(ti) 與(yu) 抗原的結合：凝集素與(yu) 細胞表麵抗原以及某些糖類的結合等。

分離原理如圖所示：

將可以與(yu) 目標分離分子產(chan) 生特異性相互作用的分子固定在固定相基質上，複雜樣品基質中的分子由於(yu) 不存在這種特異性作用，因此與(yu) 固定相的作用相對較弱，被率xian洗脫，目標分子最後被洗脫。

依親(qin) 和色譜固定相所帶配基與(yu) 樣品之間相互作用可將其分為(wei) 專(zhuan) 用型和通用型兩(liang) 類。親(qin) 和配基既可以與(yu) 基質直接偶聯，也可以通過間隔臂間接連接。

適當的間隔臂可以有效地克服基質表麵的位阻效應，使得配體(ti) 更容易與(yu) 被分離物結合，帶有間隔臂的AFC固定相往往具有更為(wei) 優(you) 異的色譜性能。對以小分子為(wei) 配體(ti) 分離大分子的親(qin) 和固定相來說，間隔臂的作用顯得更為(wei) 重要。AFC固定相的間隔臂按其結構類型,主要包括烴類、鏈狀的聚胺類、肽類、鏈狀聚醚類等。氨烷基化合物NH₂(CH₂)nR，R是常用的間隔臂，其中，R可為(wei) 羧基、羥基、氨基或配位體(ti) 自身。具有疏水性的間隔臂可能與(yu) 配基或樣品間產(chan) 生非特異相互作用,幹擾親(qin) 和分離。為(wei) 消除非特異性吸附幹擾,可在沿間隔臂分子的長軸方向某些原子上偶聯亞(ya) 氨基、羥基等官能團，增加親(qin) 水性。

親(qin) 和色譜固定相上固定的配基包括染料配基、金屬離子配基、包合配合物配基、特異性民基、電荷轉移配基和共價(jia) 配基。三嗪活性染料的結構與(yu) 生物酶的天然底物接近,可與(yu) 酶活蛋白質的活性位點結合應用於(yu) 親(qin) 和色譜。Cu²⁺、Zn²、Ni²⁺、Fe²⁺、Fe³⁺等金屬離子通過具有整合作用的有機官能團固定在基質或間隔臂上,利用螯合物中的金屬離子與(yu) 生物分子間的特異性親(qin) 和作用實現生物分子的分離或純化。常用的螯合劑包括亞(ya) 氨基二乙酸、亞(ya) 氨基二乙醛、肟、硫脲、吡啶咪唑、8-羥基喹啉等。

包合物配基由主體(ti) 與(yu) 客體(ti) 分子間特殊親(qin) 和作用力形成,主體(ti) 化合物具有環狀知或穴,客體(ti) 分子可以被包合在環內(nei) 或空穴內(nei) 形成包合物。常用的主體(ti) 分子包括環糊精、杯芳烴等。

為(wei) 了保持生物分子的活性,一般需要采用溫和的洗脫條件。親(qin) 和色譜中通常采用具有不同pH的緩衝(chong) 溶液作為(wei) 流動相，緩衝(chong) 體(ti) 係由無機或有機弱酸、弱堿與(yu) 其鹽組成。為(wei) 保持分子的活性：P值保持在6~8之間。滿足這一條件的衝(chong) 體(ti) 係較少，包括酸鹽、三基)氨基甲烷(Tris-HCI)、硼酸鹽等。磷酸鹽緩衝(chong) 溶液緩衝(chong) 容量較小，且容易與(yu) 高價(jia) 陽離子生成沉澱，並在很多代謝體(ti) 係中起到抑製劑的作用。Tris-HCl體(ti) 係在pH<7.5時緩衝(chong) 容量小有較強反應活性,也同樣對很多代謝體(ti) 係有抑製劑作用。硼酸鹽體(ti) 係可與(yu) 眾(zhong) 多生物有機物成配合物影響分離。甘氨酰甘氨酸在pH>8時緩衝(chong) 能力ji強,但pH=7.5以下幾乎沒有緩符作用。

由Good等計研發的Goods係列衝(chong) 溶液包括12種緩衝(chong) 溶液，具有緩衝(chong) 能力強、低子強度等特征，可在pH=6.1~10.7範圍內(nei) 應用於(yu) 生物學和生理學研究。

通用型親(qin) 和配基與(yu) 溶質之間作用力通常不強,大多數情況下非選擇性流動相即可完成不同組分的分離。當生物分子與(yu) 配基形成穩定常數較小的配合物時，等度條件下，采用洗脫能力弱的、具有不同pH值的緩衝(chong) 溶液即可使配合物解離實現洗脫。當除了配位作用，還有靜電吸引力、氫鍵力或疏水相互作用等引起的非特異性相互作用存在時，可通過改變p出值離子強度、流動相極性、加入離液序列試劑等消除其幹擾。其中離液序列試劑可改變生物分子結構，使蛋白質變性從(cong) 而破壞親(qin) 和作用。采用低濃度離液序列試劑能夠在盡可能保持蛋自質分子結構基礎上實現快速洗脫。

專(zhuan) 用型親(qin) 和配基與(yu) 目標溶質間親(qin) 和作用較強，需要采用含有特定組分、具有chao強洗能力的流動相進行洗脫。此時，通常在流動相中加入另一種遊離配基以取代固定相上的配基與(yu) 目標化合物結合實現洗脫。此外，還可以通過選擇性斷裂固定相基質與(yu) 配基之間的化學鍵的方法實現洗脫。由於(yu) 洗脫後目標分子仍與(yu) 配基相連，需采用適當方法（如改變pH值或加入變性劑等）將其遊離出來。

在親(qin) 和色譜分析中，分離、純化的對象皆為(wei) 氨基酸、多肽、蛋白質、核破、核苷、核苷酸、寡聚和多聚核苷酸、核糖核酸、脫氧核糖核酸以及酶、輔酶、寡糖、多糖等生物分子，其中大多數為(wei) 極性化合物，不少還具有生物活性。因此，當從(cong) 固定相上將它們(men) 洗脫下來時需使用H值接近於(yu) 中性的稀緩衝(chong) 溶液，以在比較溫和的洗脫條件下，保持其生物活性。親(qin) 和色譜分離進行前，需先對固定相進行平衡，平衡緩衝(chong) 溶液的pH、離子強度、溫度和化學組成都應使配基與(yu) 溶質之間產(chan) 生較強的相互作用以利於(yu) 保留。溫度是親(qin) 和色譜分離的重要條件，親(qin) 和作用強度通常隨溫度升高而減小，可利用不同的溫度吸附和脫附。配基與(yu) 生物分子間相互作用達到平衡的過程緩慢,樣品應以較慢速度加載,流動相流速也不應過快。對親(qin) 和力較強的固定相，樣品體(ti) 積的影響不大；親(qin) 和力較弱時，樣品體(ti) 積不宜過大。梯度洗脫時，可采用溫度梯度、pH梯度或離子強度梯度。