水相比例在HILIC模式下對分離有何影響？

更新時間：2022-07-26 點擊次數：1400

HILIC模式中洗脫調整方向

洗脫原理主要是極性相似相容和親(qin) 水分離分配模式，洗脫時極性強的溶劑越多，保留時間越短；出峰順序是極性弱的先出，極性強的後出，與(yu) 反相相反，因此適合保留極性強，在反相上無法保留的物質。

實例

CTP、ATP、GTP、UTP的分離：

ATP：三磷酸腺苷

GTP：三磷酸鳥苷

CTP：胞嘧啶核苷三磷酸

UTP：三磷酸尿苷

Ultimate^® AQ-C18 4.6*250mm 5μm 磷酸鹽緩衝(chong) 液（pH呈中性）-乙腈體(ti) 係，梯度運行見下表：

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效果圖

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分析：各峰分離良好，但出峰均在純鹽相段出峰，保留弱，部分目標峰的峰型不好，方法重現性不好，易與(yu) 溶劑峰重合。

根據HILIC的作用原理，該模式適合這類極性物質的分離，故Topsil^® Silica 4.6*250mm 5μm：

磷酸鹽-乙腈（25/75）

分析: 四種物質分離*，保留適中，但有雜質峰幹擾風險，峰形有可以優(you) 化的空間，減少水相，延長保留。

磷酸鹽-乙腈（20/80）

分析：分離良好，峰形改善，雜質無幹擾，各目標峰保留增強很多，一針運行時間較長，流動相中水相比例對保留與(yu) 分離影響較大，與(yu) HILIC的分離原理符合，水相為(wei) 強洗脫能力項，微小比例的改變對色譜效果影響大，水相比例減小。

磷酸鹽-乙腈（22/78）

分析：與(yu) 預期相一致，保留時間縮短，與(yu) 雜質能較好分離，可以嚐試梯度，在HILIC模式中水相的微小變化對色譜圖影響大，因此兩(liang) 針之間的平衡時間建議在10倍柱體(ti) 積以上，而且平衡時間一致，也可以讓係統達到一個(ge) 動態平衡，以保證分離效果的重現。

結論

運行HILIC模式時：

1. 考慮樣品極性和溶解性：首先目標一般是強極性物質，且最好是在高比例有機相中有一定溶解性，如果樣品在有機相中不溶或溶解度很低，或容易產(chan) 生其他反應的，則不適用；

2. 考慮緩衝(chong) 鹽與(yu) 有機相的互溶性：調節流動相比例時，如果流動相中含鹽，要考慮鹽在有機相中的溶解度，避免出現鹽析等現象；

3. 關(guan) 注係統真正的平衡狀態：係統平衡不僅(jin) 僅(jin) 是關(guan) 注基線噪音和漂移的問題，是連續進樣獲得穩定的保留時間和峰麵積，測試過程中會(hui) 碰到係統平衡慢的問題，需要附上解決(jue) 或改善方法；

4. 關(guan) 注樣品的穩定性：確保所使用的樣品溶液是zui接近初始狀態的，測試過程中需關(guan) 注溶液穩定狀態，必要時臨(lin) 用新製；根據整個(ge) 方法時樣品的主峰情況確定最終的配製方法和保存方法。