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021-50276769最近月旭科技除了產(chan) 品以外，我們(men) 發布的內(nei) 容也越來越受到大家的喜愛，遭到了多家公眾(zhong) 號的自主發布，熱度也頗高，我們(men) 十分“欣慰"。我們(men) 的內(nei) 容能夠得到大家的喜歡，真的是我們(men) 最高興(xing) 的事情。但是其發表的內(nei) 容因為(wei) 水印等問題，譜圖截取並不完整，影響大家的觀看體(ti) 驗。所以小編就來以正視聽，將完整的譜圖，以及最完整的雜質分離方法開發過程分享給大家，我們(men) 一起變得更強！
首先來看看需要分離的三個(ge) 物質的結構式：
01 分析目的要求
開發一種合適的分析方法，使上述3種化合物在濃度1.0mg/mL的情況下分離度大於(yu) 1.50。
開始方法開發之前，第一件該做的事是什麽(me) 呢？
當然是去了解這幾個(ge) 物質的性質，盡可能的得到有關(guan) 這些物質的信息，這樣可以為(wei) 後麵工作節省最多的時間。而對這三個(ge) 物質得到的信息大致如下：三種物質極性比較強，水溶性比較好，在常規C18色譜柱保留太弱，基本上與(yu) 溶劑峰重疊。結構式上主要是官能團的差異，分別為(wei) -NH2，-Br，-COOH，差異性很大。
綜合考慮，有兩(liang) 種方案：一是加離子對試劑，用反相C18色譜柱增強保留，進行分離；二是使用離子交換色譜柱進行分離。首先由於(yu) 個(ge) 人的習(xi) 慣，離子交換色譜被我直接排除（離子色譜平衡比較慢，而且離子交換色譜柱非常容易出現重現性問題）。所以本實驗采用C18添加離子對試劑的方法。
考慮的實驗過程中需要使用離子對試劑，且流動相pH需要大範圍調整（可能用到堿性流動相），所以色譜柱選擇月旭Xtimate ® C18（4.6×250mm，5μm）色譜柱，流速：1.0mL/min，柱溫30℃，檢測波長220nm。
02 流動相優(you) 化及測試結果圖譜
2.1 初步嚐試流動相：0.05mol/L庚烷磺酸鈉+0.05mol/L磷酸二氫鉀，PH=4.60。
結果：化合物3保留時間2.6min，化合物1不出峰。估計是化合物1保留太強未洗脫下來。接下來，調整pH並增加有機相的比例，來加大洗脫能力。
2.2 流動相：緩衝(chong) 液（1.00g辛烷磺酸鈉，10mM磷酸二氫鉀至500mL水中，用磷酸調pH=2.30）：甲醇=60：40。
混合對照圖譜如下：
實驗中將庚烷磺酸鈉改為(wei) 辛烷磺酸鈉，增加有機相（甲醇）比例，結果三個(ge) 物質分離良好，但是化合物1（19.9分鍾）峰型太差，下一步優(you) 化化合物1的峰型。
2.3 流動相：緩衝(chong) 液（1.00g辛烷磺酸鈉，10mM磷酸二氫鉀至500mL水中，用磷酸調pH=2.30）：乙腈=80：20。
化合物1圖譜：
基於(yu) 上一次實驗，將有機相甲醇變為(wei) 乙腈，通過改變選擇性看是否峰型會(hui) 有改善。結果發現並沒有任何改善，而且發現這個(ge) 方法中有機相隻提供洗脫能力，不提供選擇性改變作用。
2.4 流動相：緩衝(chong) 液（緩衝(chong) 液：1.00g十二烷基磺酸鈉，50mM氯化銨至500mL水，用磷酸調pH=1.80）：甲醇=60：40。
混合對照圖譜：
當時換成這個(ge) 流動相的主要思路是，加十二烷基磺酸鈉使保留更強，加氯化銨提高離子濃度，調pH至1.80強酸性使化合物1中-NH2官能團作用更弱，達到優(you) 化峰型的目的，但是效果很差。回頭總結發現我們(men) 所有的目光都聚焦在三種物質的不同官能團上，導致越走越偏離分離的軌跡，這裏，三個(ge) 物質共同含有的官能團可能也是影響分離的主要因素，換了個(ge) 角度後，豁然開朗了。推fan了之前的方案，將離子對試劑換為(wei) 四丁基氫氧化銨，從(cong) 頭開始。
2.5 流動相：緩衝(chong) 液（4mL 10%四丁基氫氧化銨水溶液，1.36g磷酸二氫鉀至500mL水中，用三乙胺調pH=9.30）：乙腈=80：20。
混合對照圖譜：
流動相中添加三乙胺和並將pH調成9.3目的是抑製化合物1的拖尾，但是結果發現三種物質沒有分開。繼續優(you) 化條件將pH值降低。
2.6 流動相：緩衝(chong) 液（4mL 10%四丁基氫氧化銨水溶液，1.36g磷酸二氫鉀至500mL水中，用三乙胺調pH=7.00）：乙腈=80：20。
混合對照圖譜：
看到這結果是不是項目就OK了。但是既然是方法開發，方法重現性實驗實驗是必bu可少的，需要用一根新色譜柱重現該色譜條件。
結果問題就來了.....
化合物1圖譜：
化合物1峰型一直分叉，最終發現應該是色譜柱使用多種離子對試劑，造成色譜柱改性，新色譜柱不能重現結果。好吧，再開始。
然後又是繼續摸索。不得不說有時候運氣也是成功的一部分，在一次流動相配置過程中，看到四丁基氫氧化銨試劑旁邊還有一瓶四丁基溴化銨，突然我就冒出想法，用四丁基溴化銨試試，不知道結果會(hui) 怎麽(me) 樣，說做就做。
2.7 流動相：緩衝(chong) 液（1.00g四丁基溴化銨，1.36g磷酸二氫鉀，1.0mL三乙胺至500mL高純水。用磷酸調節pH=7.10）：乙腈=80：20。
混合對照圖譜：
03 結果
結果：分離度，峰型都滿足要求，wan美。當然還是需要重現方法的。
三根新色譜柱重現結果：
最終色譜條件：
色譜柱：月旭Xtimate® C18（4.6*250mm，5μm）。
流動相：緩衝(chong) 液（1.00g四丁基溴化銨，1.36g磷酸二氫鉀，1.0mL三乙胺至500mL高純水。用磷酸調節pH=7.10）：乙腈=80：20
檢測波長：220nm；
柱溫：30℃；
流速：1mL/min；
進樣體(ti) 積：10μL。
搞定交差！
04 實驗小結
在液相應用方法開發過程中，首先需結合需要分離的目的，確定思路，一個(ge) 方法最初的思路，是決(jue) 定這個(ge) 方法開發的效果，效率的最根本因素；其次是細節，任何細節都有可能導致你實驗的成功與(yu) 否；最後是運氣，牛頓發現萬(wan) 有引力還有運氣成分呢，說不定你是下一個(ge) 。
同時，在一個(ge) 方法確定好之後，一定需要使用一根新的色譜柱來驗證，因為(wei) 在方法開發過程中，我們(men) 會(hui) 使用到各種流動相條件，會(hui) 對色譜柱一個(ge) 改性，特別是使用離子對試劑的方法，否則後續的重現性問題會(hui) 是一個(ge) 非常頭痛的事情。
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