液相色譜，你問我答（十四）

什麽(me) 是液相係統的梯度滯留體(ti) 積？

它對分析有什麽(me) 影響？

答：梯度滯留體(ti) 積是梯度混合點到柱子進口之間的體(ti) 積。這個(ge) 體(ti) 積導致梯度有一定延遲，因而也叫做梯度延遲體(ti) 積。

現在很多液相係統都是單泵低壓梯度係統，就是說梯度是在泵的上遊混合 的。梯度延遲體(ti) 積的第一個(ge) 部分是梯度混合器的體(ti) 積。這樣，你就要加上梯度混 合器和泵頭之間的連接體(ti) 積。第二個(ge) 是泵頭的體(ti) 積，然後是進樣器的連接管路。通常，這個(ge) 體(ti) 積增大一點來充分混勻流動相而使梯度平滑一點。進樣器到進樣器 和柱頭之間的體(ti) 積是另一個(ge) 部分。看看在通常的低壓梯度係統中，梯度滯留的地 方相當多…

也可以再高壓一邊產(chan) 生梯度。這最少需要2個(ge) 泵，可以盡量減少梯度延遲體(ti) 積。但是高壓梯度係統不是這樣設置的。通常，連接位置在進樣器之前。好處是樣品不管怎麽(me) 樣都能進入柱子，而不用依賴哪個(ge) 泵的流速。最好是用初始流動相來溶解樣品，這樣梯度延遲體(ti) 積可以*不記了。這個(ge) 技術的一個(ge) 小缺點就是樣品會(hui) 被流動相的第二個(ge) 組分稀釋一點點，但是如果初始流動相是90%的流動相A的話這個(ge) 問題就很小了，隻稀釋了10%。另一個(ge) 問題是通常大部分峰會(hui) 聚集在柱頭，這樣在開始的等度洗脫中隻有一小部分峰被洗脫下來。這時，我們(men) 要確保進樣器與(yu) 柱頭之間的體(ti) 積要足夠小。高壓梯度係統就沒有這種問題。

下麵我們(men) 來討論一下梯度延遲體(ti) 積怎樣影響分析！由於(yu) 梯度到達柱子需要時間，因此梯度一開始就延遲了，開始這段時間就是跑等度。第一個(ge) 影響就是前麵 的峰換個(ge) 係統後保留時間可能就不一樣了。如果梯度延遲時間比較明顯，那麽(me) 色譜圖中前期的峰就會(hui) 明顯不同，而梯度後期則與(yu) 延遲體(ti) 積不怎麽(me) 相關(guan) 。但是洗脫時間還是會(hui) 隨梯度延遲時間改變。這些情況都很讓人頭疼。這就是為(wei) 什麽(me) 在QC實驗室中避免使用梯度的原因。畢竟樣品時通過保留時間來定性的，如果換儀(yi) 器後保留時間不一樣，那麽(me) 就不好判斷了。當然也可以通過標準品的保留時間來判斷，但是還是不叫複雜….

我同意，那確實有點複雜，但也不是

無法克服的。還有其他要考慮的嗎？

答：如果在低壓係統中混合體(ti) 積較大，那麽(me) 你觀察到的梯度圖譜不會(hui) 很尖銳。這通常不會(hui) 影響標準線性梯度，但是如果是階梯狀的梯度就會(hui) 影響洗脫了。通常用延遲體(ti) 積小的梯度係統，現在很多HPLC係統的梯度延遲都很小。對於(yu) 循環時間小的非常快速的梯度，即使延遲體(ti) 積再小也不夠。這時可以采 用延遲進樣技術。理論上，梯度還是按通常的運行，但是直到梯度到達進樣器時才進樣。這樣就想沒有梯度延遲體(ti) 積一樣。當然進樣環以及進樣器到柱頭的管路的體(ti) 積還是有一定的延遲，但是小的可以忽略了。

當梯度運行完後，柱子會(hui) 重新開始平衡，也是有延遲。所以我們(men) 不用等到柱子重新平衡好後再開始新的梯度，我們(men) 隻要知道設計的程序，泵的運行與(yu) 柱頭實際發生的不一樣就行了。梯度運行和柱子再平衡被排空梯度延遲體(ti) 積抵消了。這個(ge) 解決(jue) 方法讓我們(men) 可以在單泵係統中實施沒有延遲的快速梯度。另外，如果在不同的儀(yi) 器上運行同樣的梯度，延遲體(ti) 積造成的影響會(hui) 很小。這樣我們(men) 就可以在不同的儀(yi) 器上重複梯度。當然，以上都是假設梯度發生器穩定工作，可重複並且能確實按要求工作。

怎麽(me) 測量梯度延遲體(ti) 積呢？

怎麽(me) 確定係統的梯度確實是想要的呢？

答：有個(ge) 標準測試非常有用，參考《JJG 705 2014液相色譜儀(yi) 檢定規程》中對梯度檢定的部分。不接柱子，在流動相B中加少量的UV吸收劑0.1%丙酮，然後運行梯度。這可以觀察真實的梯度。從(cong) 程序與(yu) 實際的差別中可以檢測到係統的梯度延遲體(ti) 積。如果你采用延遲進樣，你就必須要了解這點。對係統了解的越多，在梯度分析中浪費的時間就會(hui) 越小。