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緩衝(chong) 液的pH和濃度
離子交換色譜通常至少會(hui) 使用兩(liang) 種不同的緩衝(chong) 液：一種用於(yu) 蛋白質上樣並洗去不吸附的雜質，稱為(wei) 起始緩衝(chong) 液；另一種用於(yu) 洗脫吸附在柱上的蛋白質，稱為(wei) 洗脫緩衝(chong) 液。
達到最終pH和鹽濃度的洗脫緩衝(chong) 液稱為(wei) 極限緩衝(chong) 液。這裏又分為(wei) 兩(liang) 種情況，在完成吸附後將目的蛋白洗脫下來有兩(liang) 種方法：一種是通過改變pH，使蛋白質的帶電狀態發生變化而不能結合在交換劑上，此方法會(hui) 用到兩(liang) 種不同pH的起始和洗脫緩衝(chong) 液；另一種是通過增加離子強度，雖然不改變蛋白質的帶電狀況，但高的離子強度會(hui) 降低蛋白質與(yu) 離子交換劑之間的靜電引力，從(cong) 而將蛋白質洗脫下來，此方法會(hui) 用到兩(liang) 種pH相同而離子強度不同的緩衝(chong) 液，通常極限緩衝(chong) 液是向起始緩衝(chong) 液中添加特定濃度的鹽類而形成。
為(wei) 了保證目的蛋白在吸附階段能結合到交換劑上，起始緩衝(chong) 液的濃度一般比較低，介於(yu) 0.01-0.05mol/L。但過低的起始濃度有可能造成蛋白質在離子交換劑上吸附過於(yu) 牢固而給洗脫造成困難，同時也應當控製吸附階段的時間。研究顯示，將蛋白質吸附在離子交換柱上過夜再進行洗脫，比直接進行洗脫明顯困難，這是由於(yu) 長時間的吸附會(hui) 引發蛋白質的構象緩慢發生改變，這種改變使之與(yu) 交換劑結合更為(wei) 牢固，並且這種構象變化一般都會(hui) 造成蛋白質活性下降。合適的起始緩衝(chong) 液濃度可以通過小樣試驗確定。
在采用改變pH的方法洗脫時，洗脫緩衝(chong) 液的緩衝(chong) 成分種類往往與(yu) 起始緩衝(chong) 液相同，隻是控製比例關(guan) 係不同造成最終pH不同。洗脫緩衝(chong) 液在濃度方麵並沒有特殊的要求，常與(yu) 起始緩衝(chong) 液相同。在采用增加離子強度的方法洗脫時，所用洗脫緩衝(chong) 液在緩衝(chong) 物質種類、pH和濃度上往往都與(yu) 起始緩衝(chong) 液相同，通常是通過向起始緩衝(chong) 液中添加特定濃度的其他種類鹽 （如NaCl）來增加離子強度。
所以，實際上無論是何種緩衝(chong) 液，緩衝(chong) 物質的濃度通常都不大，為(wei) 了使其具有足夠的緩衝(chong) 能力，必須滿足一定的條件。根據Henderson-Hasselbalch公式：
當緩衝(chong) 液的pH接近緩衝(chong) 物質的pKa時，才具有良好的緩衝(chong) 能力。最大緩衝(chong) 能力出現在pKa處，偏離pKa值1個(ge) pH單位緩衝(chong) 能力將下降5倍。一般來說，緩衝(chong) 液的有效pH範圍約為(wei) pKa±2pH單位，而要獲得足夠強的緩衝(chong) 能力，pH最好在pKa±0.5pH單位之間。當弱酸（或弱堿）與(yu) 對應的鹽的物質的量之比接近1:1時，此緩衝(chong) 體(ti) 係的緩衝(chong) 能力*。所以在選擇緩衝(chong) 液時，首先應根據起始緩衝(chong) 液所需要的pH，選擇pKa值與(yu) 之接近的緩衝(chong) 物質，使弱酸（或弱堿）與(yu) 對應的鹽的物質的量之比接近1。需要注意的是，緩衝(chong) 物質的pKa值是會(hui) 隨溫度變化的，在溫度相差較大時會(hui) 對溶液pH產(chan) 生明顯的影響。例如，在室溫下配製出的Tris緩衝(chong) 液比在冷藏室（4℃）中的低0.05個(ge) pH單位。
離子對色譜行為(wei) 的影響
采用增加離子強度的方法洗脫蛋白質時，通常選用某種非緩衝(chong) 鹽類，zui常用的是NaCl，添加到起始緩衝(chong) 液中，構成了洗脫緩衝(chong) 液。在進行色譜分離時，洗脫緩衝(chong) 液中的緩衝(chong) 物質固然會(hui) 影響到色譜效果，實際上非緩衝(chong) 鹽的種類和性質同樣會(hui) 影響到色譜時的分辨率和選擇性，使用不同的非緩衝(chong) 鹽離子時，可能造成不同物質被洗脫的先後順序發生變化，因此非緩衝(chong) 鹽的選擇同樣具有重要意義(yi) 。
在前麵離子交換理論部分討論過，價(jia) 態高的離子與(yu) 交換劑的結合力更強，所以一般情況下，多價(jia) 離子是比一價(jia) 離子更好的置換離子，它們(men) 能使蛋白質比較早被洗脫下來 （保留值小）。所以在陽離子交換劑上，蛋白質的保留值與(yu) 置換離子的關(guan) 係為(wei) ：Ba2+＜Ca2+＜Mg2+＜NH4+＜K+＜Na+＜Li+，但也存在例外，比如對於(yu) 溶菌酶來說，NH4+是比Mg2+更有效的置換離子。在選擇置換離子時，應當考慮到多方麵的因素，強的置換離子能有效縮短色譜時間，但往往也降低蛋白質回收率。一般情況下選擇置換能力居中的鹽離子較為(wei) 合適，在洗脫與(yu) 交換劑牢固結合的蛋白質時，選用強的置換離子具有優(you) 勢。
不但置換離子，洗脫鹽中與(yu) 功能基團帶同種電荷而不參與(yu) 離子交換過程的離子也會(hui) 影響到蛋白質的色譜行為(wei) ，原因也有多種。有些是因為(wei) 離子與(yu) 蛋白質發生作用導致的。此外，二價(jia) 離子如Ca2+和Mg2+能與(yu) 蛋白質分子中的酰胺基形成複合物而影響到其色譜行為(wei) 。
總之，離子對色譜行為(wei) 的影響是多方麵的，沒有一定的規律。在首ci進行色譜分離時，可優(you) 先選擇比較通用的一些緩衝(chong) 物質和鹽類，在此基礎上再進一步優(you) 化。
添加劑
在有些情況下，在進行離子交換時還會(hui) 添加一些其他的化合物，其作用主要有：增加蛋白質的溶解度，提高色譜分辨率，保護待分離物質等。大多數蛋白質是溶於(yu) 水的，但也有部分蛋白質疏水性比較強，在水中的溶解度很小，這使得色譜操作難於(yu) 實現。具體(ti) 例子是膜蛋白的分離。膜蛋白存在於(yu) 生物膜中，其表麵是疏水區，與(yu) 生物膜中疏水性的脂質成分以疏水相互作用結合，這類蛋白在水中是不溶的或溶解度很低。向溶液中添加非離子型或兼性離子型去汙劑可以使膜蛋白溶解並分散在水溶液中，便於(yu) 色譜的進行。有機溶劑（如氯仿、甲醇等）也能增加疏水性蛋白質的溶解度，而且由於(yu) 有機溶劑降低溶液的介電常數，使得蛋白質與(yu) 交換劑之間的靜電作用力更強，吸附更為(wei) 牢固。
某些情況下，添加特定的物質還能提高色譜時的分辨率。例如，在分離一些蛋白質時，添加甜菜堿或牛磺酸能減少蛋白聚集體(ti) 的形成及其與(yu) 交換劑的結合，從(cong) 而提高了分辨率。有的中性聚合物如聚乙二醇（PEG）能與(yu) 蛋白質競爭(zheng) 溶液中的水分子，這將增加蛋白質與(yu) 離子交換劑的相互作用而提高分辨率。分離過程中有時還需添加酶抑製劑。例如在蛋白質分離過程中，樣品體(ti) 係中如果有蛋白酶存在，會(hui) 造成目的蛋白被水解，使回收率下降，添加蛋白酶抑製劑能夠有效保護目的蛋白。絲(si) 氨酸蛋白酶常用的抑製劑是苯甲huang酰氟，巰基蛋白酶常用的抑製劑是碘乙酰胺，金屬蛋白酶可采用金屬螯合劑作為(wei) 抑製劑。
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