考馬斯亮藍法測定蛋白質含量

考馬斯藍染色法又稱Bradford法，是Bradford於(yu) 1976年建立起來的一種蛋白質濃度的測定方法。考馬斯亮藍G-250測定蛋白質含量屬於(yu) 染料結合法的一種。在遊離狀態下呈紅色，最大光吸收在488nm；當它與(yu) 蛋白質結合後變為(wei) 青色，蛋白質-色素結合物在595nm波長下有最大光吸收。

分析天平、燒杯、玻璃杯、移液槍、紫外分光光度計或酶標儀(yi) 。

①標準蛋白溶液：常用牛血清蛋白（BSA），配製1mg/mL的標準溶液。

②0.01%考馬斯亮藍染色液G-250：稱取0.01g考馬斯亮藍G-250，溶於(yu) 95%乙醇中，加85%(m/V)的磷酸10mL，最後用超純水定容至100mL，裝入棕色瓶中保存。（不宜久存，室溫1-2個(ge) 月）

紫外分光光度計測定

將表格所示溶液加入試管中充分混勻，10min後倒入比色皿，放入紫外分光光度計於(yu) 595nm測定吸光值，1號管作為(wei) 空白對照，以蛋白濃度為(wei) 橫坐標，吸光值為(wei) 縱坐標，繪製標曲作為(wei) 定量依據。

②樣品測定

取含10-100μL蛋白質溶液於(yu) 小試管中，加水稀釋至0.1mL，然後加入5mL G-250蛋白染色液，充分混勻，10min後倒入比色皿，放入紫外分光光度計於(yu) 595nm測定吸光值，1號管作為(wei) 空白對照，將測得吸光值帶入標準曲線計算樣品中的蛋白質含量。

酶標儀(yi) 測定

將表格所示溶液依次加入酶標板中混勻，靜置10min後，放入酶標儀(yi) 中於(yu) 595nm測定吸光值，A孔作為(wei) 空白對照，以蛋白濃度為(wei) 橫坐標，吸光值為(wei) 縱坐標，繪製標曲作為(wei) 定量依據。

②樣品測定

取含4-40μL蛋白質溶液於(yu) 酶標板中，加水稀釋至40μL，然後加入250μL G-250蛋白染色液，充分混勻，靜置10min後，放入酶標儀(yi) 於(yu) 595nm測定吸光值，A孔作為(wei) 空白對照，將測得吸光值帶入標準曲線計算樣品中的蛋白質含量。

①通常會(hui) 將樣品稀釋多個(ge) 梯度進行測定，防止樣品測得吸光值過高，超出標曲導致的含量計算偏差。

②樣品中若含有去汙劑，如TritonX-100、SDS等，會(hui) 嚴(yan) 重幹擾測定結果。

③比色反應需在1h內(nei) 完成，如果測定要求很嚴(yan) 格，可以在染色液加入後的5-20min內(nei) 測定吸光值，因為(wei) 在這段時間內(nei) 顏色是zui穩定的。

④測定時，蛋白-染料複合物會(hui) 有少部分吸附在比色皿杯壁上，測試完後可用乙醇溶液將比色皿中的殘留物衝(chong) 洗掉，再用超純水衝(chong) 洗幹淨保存。