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021-50276769蛋白與(yu) 配體(ti) 能否結合、結合的強弱會(hui) 直接影響蛋白檢測或純化實驗的成敗。此篇文章由月旭科技首xi科學家王國斌博士執筆，對蛋白結合和解離常數進行了較為(wei) 係統的講述。
蛋白和配體(ti) 結合的強弱不同，對於(yu) 蛋白檢測以及親(qin) 和分離純化實驗有顯著影響。在設計實驗時應考慮這種結合強弱影響，以便采用合適的蛋白或配體(ti) 濃度（包括zui低檢測限濃度），估算結合時間，獲得最佳並且實用的結果。 這對於(yu) 室溫下易失去活性，或希望盡可能保持最高活性蛋白的純化尤為(wei) 重要。
常規的蛋白檢測方法，比如ELISA，隻能測定實驗結束時的蛋白結合數值，不能跟蹤整個(ge) 過程。這不利於(yu) 獲取結合的動力學數據，阻礙了實驗的優(you) 化。自從(cong) 上個(ge) 世紀90年代Biacore商品化surface plasmon resonance技術後，目前已有幾種生物傳(chuan) 感器技術，能夠跟蹤蛋白和配基的real-time結合過程，檢測結合的全部過程，給出結合的動力學數據。下圖是我在SRU Biosesystems用光學生物傳(chuan) 感測定蛋白A和不同濃度人類IgG隨時間變化的結合曲線。IgG濃度在100μg/mL時，結合在2-3分鍾內(nei) 迅速上升後，緩慢增加。在濃度減小時，結合速度變慢。濃度在6.25μg/mL時，結合在180分鍾內(nei) 持續穩定地增加。濃度小於(yu) 1μg/mL時，結合仍然進行，但是十分緩慢。
絕大多數生化實驗室，沒有real-time跟蹤檢測手段，蛋白檢測或者純化過程中，確定蛋白的濃度和結合時間通常根據結合的強弱來確定，而結合強弱是通過解離常數來判斷的。
在化學、生物化學中，解離常數（KD) 是一種反應的平衡常數，用於(yu) 測量較大物體(ti) 可逆地分離（解離）成較小成分的傾(qing) 向。解離常數是結合常數的倒數。 雖然解離常數是動力學理論的參數， 但是它在生物化學，尤其實驗設計上有現實意義(yi) 的指導作用。
對於(yu) 一個(ge) 可逆的蛋白結合過程
（1）P+L⇌P L
PL是蛋白P和配體(ti) L的親(qin) 和產(chan) 物。解離常數KD定義(yi) 為(wei)
（2）KD=[P]e[L]e/[PL]_e=1/KA
其中[P]e’[L]e和[PL]e分別是到達平衡時，P、L和結合物PL的濃度。KA是結合常數。結合率ϴ定義(yi) 為(wei) 蛋白P與(yu) 配體(ti) L結合成PL的比例。
（3）ϴ=[PL]_e/[P]t
[P]t是起始的蛋白P總濃度。平衡時蛋白濃度
（4）[P]e= [P]t-[PL]e
等式（2）變成
(5) KD=（[P]t-[PL]_e）[L]e/[PL]
等式（5）變成
(6) [PL]_e/[P]t=[L]e/(KD+[L]e)
結合率ϴ轉化為(wei)
（7） ϴ=[PL]_e/[P]t=[L]e/(KD+[L]e)
平衡時省餘(yu) 未結合配體(ti) 濃度
（8）[L]e=ϴ KD/(1-ϴ)
當蛋白L有一半結合時，ϴ=0.5
（9） [L]e=KD
最後平衡狀態結合配體(ti) 的濃度就等於(yu) 解離常數。下麵闡述其實用價(jia) 值。
例如KD為(wei) 1nM時，最後剩餘(yu) 的配基平衡濃度為(wei) 1nM，一半的蛋白會(hui) 與(yu) 配體(ti) 結合（ϴ=0.5）。KD為(wei) 5nM時，最後剩餘(yu) 的配體(ti) 平衡濃度為(wei) 5nM時，一半的蛋白會(hui) 與(yu) 配體(ti) 結合（ϴ=0.5）。如果想要提高蛋白結合率到六成（ϴ=0.6圖中紫線），就要增加配基濃度，達到最後配基平衡濃度分別為(wei) 1.5nM（KD=1nM）和7.5nM（KD=5nM）。對於(yu) 蛋白A填料來說，配體(ti) 就是抗體(ti) ，不同動物/總類的抗體(ti) 有不同的KD。如果給與(yu) 足夠時間，結合達到平衡後（靜態載量），沒結合抗體(ti) 的濃度也不同。KD小，會(hui) 有更高的靜態載量，分離得更*。 要想提高低KD抗體(ti) 的載量，隻能提高填料表麵蛋白A的密度。如果時間短，沒有達到最後的結合平衡，現實的例子就是抗體(ti) 流過蛋白A填料柱。在相同時間裏，KD小的，會(hui) 有更多的抗體(ti) 與(yu) 蛋白A結合。對於(yu) 同樣的KD流速低，時間長，動態載量也會(hui) 更高。
反之， 在最後配體(ti) 平衡濃度為(wei) 8nM（圖中紅線）時，KD小（1nM）的蛋白結合率能達到0.89，而KD大（5nM）的蛋白結合率隻有0.62。 這對於(yu) 無蛋白檢測時，試劑濃度選定有幫助。比如ELISA的二抗（檢測抗體(ti) ）或者熒光標記的二抗以及鏈黴親(qin) 和素（Streptavidin）濃度確定後，KD對蛋白（被檢測物）的濃度測定的影響就顯而易見。KD小的被檢測蛋白，比如蛋白A或者蛋白A的填料，結合率高，檢測結果更準確。如果KD較大，就要提高二抗濃度，以確保檢測數據可信度，或者縮短實驗周期。
在分子生物學上，KD<10-8M (10nM或者0.01μM)屬於(yu) 強結合； 10-4M>KD>10-8M屬於(yu) 中等結合；KD>10-4M (0.1mM)屬於(yu) 弱結合。蛋白A與(yu) 不同種類抗體(ti) 結合的強弱不同。例如protein A與(yu) 人類IgG1、IgG2和IgG4的KD約為(wei) 2×10−9M，屬於(yu) 強結合。下表列出不同抗體(ti) 與(yu) 蛋白A結合的強弱情況。蛋白檢測，分離純化過程中，應該參照結合強弱，設計操作方案。
鏈黴親(qin) 和素（streptavidin）是生物化學常用的試劑。它於(yu) 生物素（biotin）結合的KD非常小，僅(jin) 為(wei) ~10−14M。 強度與(yu) 共價(jia) 鍵類似。前文介紹過，鏈黴親(qin) 和素是非常穩定50KD蛋白，經常用來與(yu) 熒光、紅外、ELISA標記等化學結合而不失去其生物活性。生物素是分子量244，帶有羧基的小分子。 容易與(yu) 蛋白化學結合。這樣帶有標記的鏈黴親(qin) 和素，與(yu) 帶有生物素的蛋白結合，從(cong) 而避免直接標記蛋白。鏈黴親(qin) 和素和生物素KD小。對比於(yu) 直接標記二抗的方法，采用標記的鏈黴親(qin) 和素-生物素的方法用量小、時間短，達到準確檢測的目的。基於(yu) 這種原因，標記的鏈黴親(qin) 和素、化學活化的生物素以及生物素結合的二抗等蛋白檢測試劑，比較容易購買(mai) ，這對於(yu) 實驗方案設計非常便利。
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