液相色譜，你問我答（十）

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問：我要開始開發一個(ge) 新的HPLC方法。驗證之後，該方法將轉道QC實驗室並將使用許多年。我擔心該方法的長期的重複性，特別是柱子的長期重複性。怎樣才能確保好的重複性呢？

答：首先，我要表揚你在開始做這個(ge) 方法的時候就能考慮到這個(ge) 方麵。如果可以預料到該方法將要使用好幾年，在選擇柱子方麵就要做些功課。要想使柱子在該方法的可預見的適用期內(nei) 使用，就要選擇一些大的生產(chan) 廠家。另外，要選擇一種標準的表麵化學物質（比如C18或C8）而不是那些新奇的或很少使用的。

下一個(ge) 標準才是柱子的重複性，如果你或你的同事以前用過一根柱子有很好的重複性，這是一個(ge) 很好的起點，同時也要考慮生產(chan) 商提供的信息。近來有的廠家開始印刷他們(men) 的說明和不同批次的重複性實驗的結果。你可以從(cong) 廠家得到這些信息然後細心對照。

問：我該從(cong) 這些信息中尋找什麽(me) 呢？

答：我們(men) 先來解釋一下不同柱子和批次之間重複性的不同方麵。下麵就說一下反相填料，因為(wei) 他們(men) 更加普遍。

如果你用同一批填料的不同柱子，將會(hui) 得到不同的塔板數（峰寬），不同的柱壓，不同的保留時間。保留時間與(yu) 填料密度和柱體(ti) 積呈比例改變，而柱體(ti) 積則取決(jue) 於(yu) 柱子的內(nei) 徑。這個(ge) 改變對你的方法應該是沒什麽(me) 影響的，因為(wei) 所有峰的保留時間都呈比例的改變，而分離度還是沒變。這個(ge) 原因導致的保留時間變化的RSD通常在3%左右，但是如果生產(chan) 商對柱子的硬件有很好的控製，RSD也可以低到1%。柱子塔板數的變化會(hui) 影響方法，特別是做雙峰的時候，它們(men) 很少能達到基線分離的。盡管2-3%的塔板數的標準偏差已經可以達到，但通常還是在±10%，記住塔板數是個(ge) 平方數，分離度僅(jin) 僅(jin) 取決(jue) 於(yu) 塔板數的根。所以塔板數2%的偏差相當於(yu) 峰寬1%的偏差。你要確認一下柱子的廠家是有塔板數的上下限，還是隻有一個(ge) 下限，上下限都有比較讓人滿意。

同一裝填程序的柱子其柱壓的重複性是相當好的，同一批次變化應不超過±5%。

問：那麽(me) 批次之間的重複性怎麽(me) 樣呢？

答：如果你注意一下批次間的色譜參數，你會(hui) 發現同參數會(hui) 不同，更重要的是批次間分離的選擇性也會(hui) 改變。就是說峰的相對保留會(hui) 改變，比如他們(men) 在色譜圖中的相對位置，這對你方法的確定性是不利的。

這種改變是你要盡量避免的，所以你要從(cong) 廠家那裏得到一些消息，他們(men) 是怎麽(me) 確保批次之間重複性的，這包括一些物理，化學，色譜方麵的測試。在物理測試中，最重要的一項是裝填的表麵積，該項參數的變化會(hui) 直接導致保留時間的變化。所以你要知道廠家認可的批次間表麵積改變的幅度是多少。通常情況下幅度是±10%，但是±5%也是可以達到的。化學方麵的參數最重要的是鍵合相的表麵覆蓋率。通常用多少μmol/m² 表示。許多廠家並沒有直接給出這個(ge) 參數，而隻說明了C的百分含量。我們(men) 希望看到的這個(ge) 代替性的說明以及一個(ge) 緊湊的幅度，通常是±10%，低於(yu) ±4%的也可以達到。

最後你要知道廠家的色譜重複性測試，通常色譜柱會(hui) 附帶一張色譜圖，檢測的是一些簡單的中性化合物的混合物，例如甲苯，萘和蒽等。但是這不是一個(ge) 好的批次間重複性測試。因為(wei) 這些中性疏水化合物的相對保留重複性相當好，對裝填中表麵覆蓋率的改變是相當不敏感的。好的批次間重複性測試還應在混合物中添加強堿化合物。在精心設計的測試中，精選的堿性化合物主要與(yu) 殘餘(yu) 矽羥基作用，而中性化合物則主要與(yu) 鍵合相作用。隻有含有2種化合物的重複性測試才是讓人信服的。如果一個(ge) 廠家是這樣測試的並且有好的重複性，那麽(me) 他的柱子會(hui) 更加讓人放心。

問：我不知道廠家的測試與(yu) 我的化合物的檢測有什麽(me) 聯係，我應該怎樣在我的檢測中確保一個(ge) 好的批次間重複性呢？

答：你說的很對，上麵的消息隻能讓你有一個(ge) 比較大的機會(hui) 確保重複性。但最後必須用你自己的檢測來做重複性測試。有些廠家提供一整套的設備包括不同裝填批次的柱子來做這個(ge) 測試，另外有的廠家則按要求提供不同批次的柱子，你要了解你所得到的東(dong) 西。同一裝填批次的色譜柱是沒有用的，你需要的是用不同鍵合反應裝填的柱子。如果同一批次是不同天內(nei) 裝填，然後色譜柱編號又不同的時候的時候，你最好詢問2次，確保廠家給你的是你要的。

你需要3根不同批次的色譜柱來為(wei) 你的方法做重複性測試。如果批次間的改變不影響你的檢測，那麽(me) 接下來的時間你的方法應該有一個(ge) 好的重複性。