全麵解析GST 親和層析

更新時間：2021-12-29 點擊次數：3201

概述

穀胱甘肽-S-轉移酶（GST）是生物體(ti) 內(nei) 的一類重要的代謝酶，參與(yu) 外源和內(nei) 源有毒物質的代謝。GST通過催化還原型的穀胱甘肽（GSH）和有毒物質偶聯反應，使有毒化合物的水溶性增加從(cong) 而更容易排出體(ti) 外，最終達到解毒的作用。利用這個(ge) 原理，將GST做成標簽表達出融合蛋白，與(yu) 帶穀胱甘肽配基的親(qin) 和介質特異性結合，從(cong) 而純化出目標蛋白，再用特異性的酶將GST標簽切除從(cong) 而得到天然蛋白。

GST標簽

GST標簽是一種常見的標簽，它能夠增加外源蛋白的可溶性，很好地保留了蛋白的抗原性和生物活性，可在不同的宿主中表達，適應範圍廣，能夠提高外源蛋白的穩定性，可用不同的蛋白酶去除且具有高特異性，純化方便、溫和。但它也有一定的缺點，比如分子量較大，可能會(hui) 影響蛋白質的功能和下遊實驗，因此純化後需要去除標簽，並且如果蛋白不可溶，很難用變性的方法純化。

GST親(qin) 和層析

GST親(qin) 和層析是利用GST融合蛋白與(yu) 固定的穀胱甘肽（GSH）通過硫鍵共價(jia) 結合，通過GSH交換洗脫的原理來進行純化。該純化柱中，凝膠手臂上通過硫鍵結合一個(ge) GSH，然後利用其與(yu) GST-tag之間酶和底物的特異性作用力，使得帶GST標簽的融合蛋白能夠與(yu) 凝膠上的GSH結合，從(cong) 而將標簽蛋白與(yu) 其他蛋白分離開。

月旭GST親(qin) 和層析填料

微信截圖_20211229113856.png

GST融合蛋白純化步驟

1.將GST Tanrose 4FF裝入合適的層析柱，層析用5倍柱體(ti) 積的結合Buffer進行平衡，使填料處於(yu) 與(yu) 目的蛋白相同的緩衝(chong) 體(ti) 係下，起到保護蛋白的作用。

2.將樣品加到平衡好的GST Tanrose 4FF中（保證目的蛋白與(yu) GST Tanrose 4FF充分接觸，提高目的蛋白的回收率），收集流出液。

3.用10-15倍柱體(ti) 積的洗雜Buffer進行清洗，去除非特異性吸附的雜蛋白，收集洗雜液。

4.使用5-10倍柱體(ti) 積的洗脫Buffer，收集洗脫液，即目的蛋白組分。

5.依次使用3倍柱體(ti) 積的結合Buffer和5倍柱體(ti) 積的去離子水平衡填料，最後再用5倍柱體(ti) 積的20%的乙醇平衡，然後保存在等體(ti) 積的20%的乙醇中，置於(yu) 4度保存，防止填料被細菌汙染。

應用實例

層析柱：PreCot 5mL GST 4FF；

樣品：重組表達GST標簽蛋白；

結合緩衝(chong) 液：20mM PB，150mM NaCl，pH7.4；

洗脫緩衝(chong) 液：15mM還原型穀胱甘肽，50mM Tris pH8.0。

微信截圖_20211229113944.png

常見問題解答

GST蛋白結合效率低，該怎麽(me) 辦？

可能原因：上樣流速太快，結合時間太短。

解決(jue) 方法：降低流速，保證足夠的結合時間

可能原因：緩衝(chong) 液不合適，柱子平衡不到位。

解決(jue) 方法：將緩衝(chong) 液pH控製在3-12之間，用至少5倍的柱體(ti) 積平衡柱子。

可能原因：樣品中GST融合蛋白濃度太低。

解決(jue) 方法：先濃縮樣品，再進行純化。

可能原因：GST蛋白發生變性或聚集。

解決(jue) 方法：選擇合適的細胞破碎方式；發生聚集時可嚐試添加1-10mM的DTT促進蛋白溶解；GST蛋白與(yu) 核酸結合或蛋白之間結合時可添加適量NaCl（100-300mM）。

GST蛋白洗脫困難，該怎麽(me) 做？

可能原因：洗脫強度不夠。

解決(jue) 方法：增加洗脫體(ti) 積數；調整洗脫緩衝(chong) 液pH（8-9）或離子強度（100-300mM氯化鈉）。

可能原因：非特異性吸附。

解決(jue) 方法：洗脫緩衝(chong) 液中加入1%-2%Triton X-100。

可能原因：洗脫緩衝(chong) 液中的穀胱甘肽被氧化了。

解決(jue) 方法：洗脫緩衝(chong) 液需現配現用，也可嚐試加入1-5mM的DTT。

GST蛋白純化後純度太低，該怎麽(me) 做？

可能原因：GST融合蛋白降解。

解決(jue) 方法：加入蛋白酶抑製劑防止降解。

可能原因：在宿主細胞內(nei) 表達過程中GST標簽脫落。

解決(jue) 方法：嚐試更換宿主細胞或者優(you) 化序列。

上一篇：蛋白含量測定常用方法有哪些？

下一篇：黃連含量的測定