液相色譜，你問我答（九）

流動相中含有緩衝(chong) 鹽時，大的原則是：使用前要過渡，使用後要清洗（清洗包括兩(liang) 個(ge) 步驟，一個(ge) 步驟是用來清洗緩衝(chong) 鹽，另一個(ge) 步驟是用來清洗強保留物質的），具體(ti) 請按如下方式保養(yang) 色譜柱。

用乙腈：水＝10：90（如果是甲醇體(ti) 係則用甲醇：水＝10：90）以1mL/min流速過渡30min，約7個(ge) 柱體(ti) 積（目的是防止緩衝(chong) 鹽在進入柱子時析出）。

步驟1）用乙腈：水＝10：90（或甲醇：水＝10：90）以1mL/min流速反向衝(chong) 洗 45min，約10個(ge) 柱體(ti) 積（目的是洗去緩衝(chong) 鹽，防止緩衝(chong) 鹽在色譜柱內(nei) 存留引起使用壽命下降）；

步驟2）再用乙腈：水＝80：10（或甲醇：水＝80：10）1mL/min流速反向衝(chong) 洗45min，約10個(ge) 柱體(ti) 積（目的是洗去分析過程中積累的強保留物質，防止強保留物質在色譜柱內(nei) 進一步積累，影響以後的分析，也防止強保留物質的積累導致的柱壓升高），然後色譜柱保存在乙腈：水＝80：10（或甲醇：水＝80：10）中。

推薦先用正己烷-異丙醇（99：1）以 0.5mL/min的流速衝(chong) 10倍柱體(ti) 積，再根據流動相選用極性相近的流動相，相同流速衝(chong) 10倍柱體(ti) 積，最後換成流動相。正相使用時，不宜分析含醛基、羰基的化合物，不可用於(yu) 還原糖的分析；流動相要*脫氣，並不得含有羰基化合物和過氧化物（質量不好的乙mi、四氫呋喃含有少量）。

先用異丙醇以0.5mL/min的流速衝(chong) 30倍柱體(ti) 積，再依次以相同的流速相同的用量用乙腈衝(chong) 柱子，在過渡到流動相體(ti) 係。再換成流動相。反相條件下使用時，要特別注意控製pH值範圍，pH值越低越有發生水解的危險，流動相中水的比例越高當然也越有發生水解的危險。最li想的pH範圍在pH2.5~8範圍，建議水相<40%以下使用。

正相條件下，可以直接采用流動相平衡係統，使用後用異丙醇以0.5mL/min流速反向衝(chong) 洗60min，最後保存在異丙醇中，正向使用。

反相條件下使用，先用異丙醇以0.5mL/min流速過渡60min，再用甲醇或乙腈衝(chong) 洗色譜柱30min以過渡到反相模式。然後再更換成流動相進行平衡如果流動相中有緩衝(chong) 鹽，使用前用采用流動相同等比例的有機相和水相進行過渡，但水相中不含緩衝(chong) 鹽。過渡30min後再換成流動相進行平衡色譜柱。

1）新柱活化：用異丙醇0.5mL/min流速衝(chong) 洗4個(ge) 小時，再純乙腈、70%乙腈水各1mL/min流速各1小時，然後用流動相衝(chong) 洗至基線平穩進樣。

2）流動相配置：建議兩(liang) 項流動相預混合，並且流動相混合前分別采用水膜和有機相膜過濾水相和有機相，然後按照比例配製混合500mL的流動相於(yu) 同一溶劑瓶中，流動相於(yu) 同一溶劑瓶中（手動預混合好），充分搖晃溶劑瓶，使兩(liang) 項混合均勻，采用超聲脫氣20分鍾，如果有變熱的跡象，放置回到室溫。

將流動相放於(yu) 儀(yi) 器上，打開儀(yi) 器泵，檢測器，在線脫氣機等電源，設置：柱溫：45℃，檢測器溫度：40℃，流速：1mL/min，打開RID檢測器參比池，衝(chong) 洗30min以後，將示差檢測器的循環按鈕打開，使得流出液從(cong) 的RECYCLE管路流出（回流管液體(ti) 流出去20min後），再將回流管放置於(yu) 流動相瓶子中，進行流動相循環。

3）循環一晚上以後，第二天將流動相循環切換至waste流路，關(guan) 閉參比池，衝(chong) 洗樣品池30min以後，基線平穩，進樣檢測。

4）如果1mg/mL濃度乳糖還是沒有出峰，配置一個(ge) 濃度為(wei) 5mg/mL濃度。

注意：晚上循環時一定是分析樣品的流動相色譜條件設置。 

Xtimate^® Sugar-Ca，Sugar-H，填料屬於(yu) 聚苯乙烯-二乙烯基苯聚合物基質，磺化強陽離子交換樹脂，在使用過程中首先要避免的情況是流動相試劑汙染色譜柱，特別避免使用純有機溶劑衝(chong) 洗造成色譜柱填料出現溶脹，改變填料性質造成色譜柱分離效果失去。

Sugar-Ca針對藥典測定甘露醇和山梨醇，也可以用測定碳水化合物，各種單糖或聚合糖測定，流動相係統和樣品溶劑基本采用純水體(ti) 係。

Sugar-H針對藥典中利巴韋林測定，也可以用於(yu) 測定碳水化合物或有機酸類物質分離，所用流動相是硫酸水溶液pH為(wei) 2.5左右。使用完後基本上采用流動相低溫4度封存，在封存過程中時間過久也會(hui) 有所長菌，故封存一段時間（2~3）周最好換新流動相封存，若長期不使用可以在流動相中加入5%乙醇做改善試劑，避免長菌現象。 

當主峰峰形有所變化，柱效有所降低時，需要進行再生；

Sugar-Ca保護柱的再生方法與(yu) Sugar-Ca分析柱方法一致，根據相關(guan) 的樣品純度有不同的變化，越是天然物（尤其是含有那些重金屬和過渡金屬元素或是有機酸的樣品），越需要經常地對柱子進行再生，因為(wei) 它們(men) 會(hui) 與(yu) 柱子發生置換。可以通過注射蔗糖來測試柱子的置換情況。如果蔗糖的峰有拖尾，那麽(me) 柱子需要做以下處理: 配製500mL的再生溶液（Ca EDTA 500mg/L Cas:23411-34-9），把柱子流路方向反過來，在85℃以 0.5mL/min的流速衝(chong) 洗一整夜。再生之後回到正常方向使用。

Sugar-H柱子的再生方法根據相關(guan) 的樣品純度有不同的變化，越是天然物，（尤其是含有那些重金屬和過渡金屬元素或是有機酸的樣品），越需要經常地對柱子進行再生，因為(wei) 它們(men) 會(hui) 與(yu) 柱子發生置換。如果主峰有拖尾，那麽(me) 柱子需要做以下處理: 配製 500mL的再生溶液（pH2.5的稀硫酸），把保護柱和分析柱作為(wei) 整體(ti) 將流路方向反過來，在85℃以 0.5mL/min的流速衝(chong) 洗一整夜。再生之後回到正常方向使用，當柱子反衝(chong) 時很重要的一點是需要保持溶劑的溫度從(cong) 而確保正確的衝(chong) 洗，用冷的溶劑將會(hui) 延緩衝(chong) 洗的過程。