液相色譜，你問我答（八）

不少做色譜分離試驗的人遇到過這樣的情形：不慎未及時補充流動相，泵將溶劑瓶中的流動相吸幹了，HPLC係統由此而停止工作了。如此情況是否會(hui) 損壞色譜柱？泵是否已將色譜柱中所有流動相都排幹了？色譜柱還能使用嗎？事實上，如果泵將溶劑瓶中的流動相吸幹，並不會(hui) 造成色譜柱的損壞。即使泵中充滿了空氣，泵也不會(hui) 將空氣排入色譜柱。因為(wei) 泵隻能輸送液體(ti) ，而不能輸送空氣。

相比之下，另一個(ge) 更可能發生的情況是忘記蓋上色譜柱兩(liang) 端的密封蓋或蓋子太鬆而使色譜柱變幹。同樣，整個(ge) 色譜柱幹涸的情況不太容易發生，多半可能隻是色譜柱兩(liang) 端的幾個(ge) 毫米變幹了，因揮發掉所有溶劑是色譜柱變幹需要相當長的時間。即使色譜柱真的變幹了，也不一定就不可救藥了。可以嚐試用一種*脫氣的、表麵張力低的溶劑（如甲醇）衝(chong) 洗色譜柱以除去氣體(ti) 。較低的表麵張力有助於(yu) 浸潤填料表麵；已脫氣的溶劑應該能夠溶解並去除滯留在填料中的氣體(ti) 。色譜柱大約需要（以1mL/min的流速）衝(chong) 一個(ge) 小時或更多的時間被*浸潤，恢複到正常狀態。

顆粒： 顆粒可以損壞泵和注射器。顆粒也可以堵塞色譜柱並且熔化它，這會(hui) 導致回壓增大。顆粒還會(hui) 表現為(wei) 另一種固相，可能改變樣品的組分。

有機物：超純水中的有機物可能影響色譜峰的分離度和積分、可能導致鬼峰、還可能改變固定相的選測性以及影響色譜基線。

離子：離子濃度的改變會(hui) 影響分離結果，部分能吸收UV的離子會(hui) 對峰產(chan) 生影響。某些有腐蝕性離子的還會(hui) 降低高壓輸液泵等配件的使用壽命。

膠體(ti) ：膠體(ti) 會(hui) 不可逆的吸附在固定相上麵，影響柱的分離效果。

微生物：微生物會(hui) 堵塞色譜柱，其代謝產(chan) 物會(hui) 增加有機物，顆粒等汙染物。

瓶裝純淨水和蒸餾水：目前部分HPLC分析中使用的純淨水，由於(yu) 瓶裝純淨水和蒸餾水均隻是普通純水而不是超純水，水中仍含有少量離子和有機物等雜質，用以配製液相和洗脫液不僅(jin) 可能汙堵昂貴的色譜柱，也影響HPLC定出平坦的基線。

瓶裝純淨水的純化工藝：通常包括吸附、過濾、反滲透等，對顆粒性有機物的去除效果較好，但對微量離子及有機物的去除卻不能滿足高靈敏度的HPLC實驗之需求，並且，由於(yu) 其包裝通常多為(wei) PVC瓶，透氧率高，同時存在一定的化學溶出量，從(cong) 而汙染瓶中的純淨水，尤其是保存一段時間後，水質下降更多，因此表現在HPLC色譜圖上，雖無特定吸收峰，但基線存在較嚴(yan) 重的不穩幹擾。

蒸餾水：是指用蒸餾方法製備的純水。可分一次和多次蒸餾水。水經過一次蒸餾，不揮發的組分殘留在容器中被除去，揮發的組分進入蒸餾水的初始餾分中，通常隻收集餾分的中間部分，約占60％，要得到更純的水，可在一次蒸餾水中加入堿性高錳酸鉀溶液，除去有機物和二氧化碳；加入非揮發性的酸（硫酸或磷酸），使氨成為(wei) 不揮發的銨鹽。通過對雙蒸水進行HPLC檢測時發現，254nm和214nm在22～27分鍾時都出現較強的吸收峰，這表明有疏水性較強的有機物汙染，其原因應是蒸餾過程的共沸現象導致了某些揮發性有機物去除不*。

超純水機：綜合了反滲透、離子交換、活性炭吸附、膜過濾、超濾及紫外光氧化等多種純化工藝，產(chan) 水電導率達到18.2MΩ•cm，產(chan) 水水質超過國標一級水標準且穩定可測，超純水即取即用，不會(hui) 因儲(chu) 存引入汙染，水質有保證，較之使用瓶裝純淨水或蒸餾水，更能滿足用戶高精度儀(yi) 器分析的需要。

很多實驗人員在使用保護柱的時候出現峰形分叉壓力升高超出儀(yi) 器報警限才考慮更換保護柱，長期檢測樣品，長時間未更換保護柱而造成分析柱出現汙染，故需要即使根據使用情況來更換保護柱。

保護柱的更換頻率通常根據經驗而定，按照每個(ge) 方法/樣品類型綜合考慮，但是許多分析人員會(hui) 在完成一定數量的樣品分析或測試一些柱的性能指標（例如增加10%峰展寬或拖尾因子，或降低10%的柱效（塔板數））後更換保護柱。

保護柱上的漏液使用保護柱時通常有兩(liang) 個(ge) 地方可能漏液，一個(ge) 是接頭的地方，另一個(ge) 位置是保護柱中間的縫隙；接頭的地方漏液，參照上述的流程處理。中間的地方漏液有兩(liang) 種可能，一種是保護柱芯可能沒有放到底，因為(wei) 運輸過程中有可能使保護柱柱芯兩(liang) 端的peek稍有變形，隻要仔細一點放進去就好；另一種是由於(yu) 卡套是手緊式的，表麵有手緊時用的紋路，有些客戶認為(wei) 隻要用手擰緊就可以了，但事實上僅(jin) 僅(jin) 通過用手來擰緊是不夠的，需要用扳手來稍緊一下，大約手緊後需用扳手繼續擰30～45度角即可。

1、一個(ge) 新的保護柱芯是沒有方向的從(cong) 第一次使用時開始保護柱芯就賦予了方向，因為(wei) 固體(ti) 顆粒物質和強保留物質總是從(cong) 入口端到達保護柱，並在這一端開始累積。所以柱芯在開始使用後應確認好方向。

2、當發現分析過程出現柱壓太高、柱效下降或分離度下降等影響分離的因素的時候，需要對保護柱進行一下維護。維護的方法如下：

通常色譜柱壓力異常升高和泵密封圈應定期更換。建議每個(ge) 液相色譜儀(yi) 用戶建立一個(ge) 泵密封圈更換的定期檢修計劃。這應根據泵的使用和流動相組成情況而定。由於(yu) 它們(men) 易磨損的特點，鹽緩衝(chong) 大大加速密封圈和活塞的磨損。在活塞下麵的泵頭上檢測到泄漏時，保留時間不穩定時，或係統壓力不穩定時，都應更換密封圈。請按照以下程序更換所維護的泵的密封圈。

柱頭塌陷：是指色譜柱使用較長的一段時間後，由於(yu) 填料中矽膠基質或鍵合相的流失，導致柱床鬆動，在單向壓力的作用下（色譜柱入口端承受絕大部分係統壓力而出口端壓力很小），整體(ti) 表現為(wei) 色譜柱的入口端出現填料缺失，嚴(yan) 重時可看到填料的缺口。

相塌陷：是指常規C18柱長時間用高含水量的流動相（>90％）長時間衝(chong) 洗後，導致保留時間逐漸變短，最後可能在色譜柱上一點保留也沒有的現象。

柱頭塌陷：通常在色譜圖上表現出柱效下降、峰形嚴(yan) 重後拖，有時候也會(hui) 出現嚴(yan) 重前拖。造成柱頭塌陷的原因，主要是由流動相和樣品引起的，1.0mL/min的流速，如果pH超標或在色譜柱pH耐受範圍臨(lin) 界點附近長時間使用，是比較容易造成柱頭塌陷的，此外，矽膠基質的溶解規律是流動pH值控製範圍是2～8，超出範圍就會(hui) 造成色譜柱出現嚴(yan) 重的破壞。建議避免使用高濃度緩衝(chong) 鹽，或者高比例純水相，或者使用耐受強酸性或者強堿性色譜柱，以保證色譜柱具有好的耐受性。

相塌陷：色譜柱出現了相塌陷後，通常用純乙腈或甲醇持續衝(chong) 洗可以使出現相塌陷的色譜柱恢複到原來的狀態，*恢複需要比較長的時間，通常30分鍾到1個(ge) 小時。