Co柱常見問題及解決方案

在水溶液中，過渡金屬離子（如Zn²⁺、Cu²⁺、Ni²⁺和Co²⁺）與(yu) 組氨酸和半胱氨酸間具有親(qin) 和作用，IMAC正是以此親(qin) 和力為(wei) 基礎。將此方法延伸應用，使金屬離子“強固定"於(yu) 載體(ti) 達到蛋白質分級分離的目的。

應根據具體(ti) 應用目的選擇固定於(yu) IMAC配基的金屬離子。三價(jia) 陽離子，如Al³⁺、Ga³⁺和Fe³⁺或四價(jia) Zr⁴⁺更適合捕獲磷酸化蛋白質和磷酸化肽，二價(jia) Cu²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺和Co²⁺常用於(yu) 純化His標記蛋白質。聯合使用四配位配基，可以確保固定化牢固，而且金屬離子（Ni²⁺、Co²⁺）保留兩(liang) 個(ge) 自由配位鍵與(yu) 生物高分子相互作用時，接受能力更高，同時回收率和洗脫蛋白質純度無明顯變化。

月旭金屬螯合親(qin) 和介質主推Ni（NTA/IDA）、Co（NTA），今天主要介紹下Co Tanrose 6FF（NTA）的基本參數與(yu) 常見問題。

• Co Tanrose 6FF （NTA）

Co Tanrose 6FF（NTA）是以高度交聯的6%瓊脂糖凝膠為(wei) 基質，氨三乙酸偶聯於(yu) 瓊脂糖而成，之後螯合Co²⁺。鈷NTA瓊脂糖凝膠FF特異性好，螯合鈷更穩定，不易脫落，能耐受更高的還原劑，物理和化學穩定性好。

• 產(chan) 品參數

解決(jue) 方案：①裂解液中含有微小的固體(ti) 顆粒，建議上柱前使用濾膜（0.22或0.45μm）過濾，或者離心去除。

②樣品中含有高濃度的核酸，加長破碎時間直至粘度降低，或者添加DNase I（終濃度5μg/ml），Mg²⁺（終濃度1mM），冰上孵育10-15分鍾。

2、樣品太粘稠

解決(jue) 方案：有機溶劑或者蛋白穩定試劑（如甘油等）可能會(hui) 引起反壓增高，降低操作流速。

解決(jue) 方案：可以通過電泳檢測裂解液分析上清中是否含有目的蛋白，包涵體(ti) 蛋白需要按照包涵體(ti) 蛋白的純化方式。

2、表達量太低

3、目的蛋白結合比較弱，在洗雜步驟被洗下來了

解決(jue) 方案：提高Wash Buffer的pH，或者降低咪唑濃度。

4、目的蛋白結合過強，不容易洗脫下來

解決(jue) 方案：降低Elution Buffer的pH值，或者增加Elution Buffer中咪唑濃度。

5、蛋白降解

解決(jue) 方案：菌體(ti) 破碎時添加一些蛋白酶抑製劑。在4°C下進行純化操作。 

解決(jue) 方案：增加Wash Buffer體(ti) 積。

2、樣品中含有其他的組氨酸標簽蛋白

解決(jue) 方案：通過調節pH值，或者咪唑濃度來優(you) 化洗雜條件。再使用其他的純化手段（如離子交換、疏水等）進一步純化洗脫組分。

解決(jue) 方案：適當降低還原劑DTT的濃度，或者改用巰基乙醇。

解決(jue) 方案：室溫下進行上樣。

2、蛋白發生聚集

解決(jue) 方案：在樣品和所有的緩衝(chong) 液中添加穩定劑，如0.1%的TritonX-100或者Tween-20。

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