液相色譜，你問我答（六)

1、流動相

（1）流動相中有機溶劑的類型和比例，會(hui) 影響色譜分離的選擇性。對於(yu) 反相色譜模式，常用的有機溶劑有甲醇、乙腈和四氫呋喃。可以通過改變流動相中的有機相種類或調整其比例，來改變選擇性和分離度。

（2）流動相的pH值影響分離度。對於(yu) 中性的化合物，流動相pH值的改變不會(hui) 對其選擇性有太大的影響；對於(yu) 酸性化合物和堿性化合物(可解離的化合物)，影響較大。

（3）可以通過添加緩衝(chong) 鹽來調整流動相的離子強度，來改善目標化合物與(yu) 固定相之間的保留。

2、固定相

固定相中鍵合相的類型，填料的孔徑，封端類型以及色譜柱的粒徑和尺寸都會(hui) 影響色譜分離的結果。其中最主要的因素是鍵合相的選擇。當你采用C18固定相無法得到好的分離結果，可以考慮極性較強的C8固定相，或者選擇性與(yu) 其有較大差異的苯基己基柱進行嚐試，或者采用封端的色譜柱代替未封端的色譜柱。

3、硬件係統

對硬件係統的一些參數進行調整，也可以在一定程度上改善色譜分離的結果。比如較高的采樣速率；采用較小內(nei) 徑的管線和較小的流通池來減小擴散體(ti) 積和延遲體(ti) 積減小色譜峰的展寬；或者通過提高色譜柱的柱溫來改善分離度。

1、所有組分響應都發生了大致相同程度的改變，可能的原因

（1）進樣問題：檢查樣品瓶和進樣針，保證樣品濃度和進樣體(ti) 積沒有變化。

（2）檢測器問題：檢查檢測器所有參數設置，如果基線噪音很大，通常不是檢測器而是係統汙染了。

（3）該組分結構是否穩定，進樣過程中可能降解。

（4）色譜條件是否發生改變，如流動相比例、pH 值等。

（5）色譜柱改變，選擇性改變，效應值也會(hui) 發生改變。 

2、隻有部分組分響應下降了

（1）看一看它們(men) 是否相似的揮發性或官能團，針對不同類型的樣品，盤查的角度可以有所不同：具有極性官能團（如-OH, -NH, -SH）的樣品易被吸附，對汙染的係統進行簡單的維護。

（2）這些成分性質是否穩定，檢測過程中是否發生降解。 

導致這種結果的原因有很多：

如果樣品穩定的話，首先排除儀(yi) 器的故障，有氣泡是最主要的一種，氣泡的產(chan) 生會(hui) 導致進樣之間體(ti) 積的不規律變化。

如果樣品之間的濃度相差很大，而進樣2-3針後同一個(ge) 峰的峰麵積保持不變，那麽(me) 可能是樣品殘留。

峰麵積的減少也有可能是溫度引起的，但是這個(ge) 影響很小，小於(yu) 2%。如果你把樣品從(cong) 冰箱裏拿出來放到進樣器裏，它會(hui) 慢慢的升溫，體(ti) 積就會(hui) 變大。這樣前後的進樣體(ti) 積就有差別了。

流速的隨機變化也會(hui) 導致峰麵積變化。流速改變的另一個(ge) 潛在原因是係統高壓部位漏液了，這個(ge) 應該很容易發現。

複雜樣品中如果有肩峰（與(yu) 目標峰局部分離），軟件就很難判斷基線在哪裏。這時采用手動積分或者用強製基線自動積分將會(hui) 改善積分的重現性。樣品本身也會(hui) 造成峰麵積變化。在反相色譜中發現有些蛋白質在開始的梯度中不能*洗脫，殘留的會(hui) 出現在接下來的空白梯度中。這些鬼峰隻在特定的蛋白質和洗脫程序中出現。如果是這樣，就要在分析樣品後添加空白。另外，蛋白質會(hui) 不可逆的黏附在有些柱子內(nei) ，隨著進樣的增加，樣品的峰麵積會(hui) 慢慢變大。

壓力波動是在日常工作中常常遇到的問題，通常來說，壓力波動與(yu) 色譜柱的關(guan) 係並不大，主要是儀(yi) 器係統的問題，下麵兩(liang) 點zui值得注意：

1、泵內(nei) 有氣泡；

2、單向閥或密封墊滲漏。

解決(jue) 的途徑如下：

1、溶劑過濾後超聲脫氣；使用在線脫氣機；打開purge閥排氣泡，或者在溶劑中充氦氣；

2、清洗更換單向閥；更換泵密封墊。

1、短期保存色譜柱

反相柱：使用緩衝(chong) 液或含緩衝(chong) 鹽的流動相，實驗完成後應用20-30柱體(ti) 積的甲醇或乙腈和水的10：90混合物進行衝(chong) 洗，在用甲醇或乙腈和水的90：10混合物進行衝(chong) 洗。如需過夜保存，可將流速保持在0.1到0.2mL/min。

正相柱：用流動相洗出樣品，再用高比例正己烷：異丙醇衝(chong) 洗色譜柱，保存。

2、保存色譜柱如色譜柱要長時間保存

必須存於(yu) 合適的溶劑下。對於(yu) 反相柱可以儲(chu) 存於(yu) 純甲醇或乙腈中，正相柱可以儲(chu) 存於(yu) 嚴(yan) 格脫水後的純正己烷中，離子交換柱可以儲(chu) 存於(yu) 水（含防腐劑疊氮hua鈉或柳硫汞）中，並將購買(mai) 新色譜柱時附送的堵頭堵上。特殊類型色譜柱的儲(chu) 存，需參考色譜柱說明書(shu) ，使用廠商推薦的溶劑。 

1、流速降低

檢查並重新設置流速；檢查泵是否有氣泡；檢查泵密封墊是否滲漏，以及單向閥和其它係統滲漏。

2、流動相組成改變

檢查係統是否有漏液點；排除係統氣泡；補足溶劑瓶；確保梯度係統比例正確；預混合流動相進行等梯度洗脫；流動相組成的問題。在反相色譜中，保留因子k和流動相中有機相的比例是成指數關(guan) 係的。通常，有機相變化1%，保留時間會(hui) 變化5%-15%，一般是10%。pH變化0.1會(hui) 導致保留時間變化10%，所以要準確的測量pH，並且要校正好pH計，在反相色譜中隨著pH的增加，酸性化合物保留時間縮短，而堿性化合物延長；離子對試劑的濃度會(hui) 影響離子型化合物組分的保留時間。帶有和離子對試劑相反電荷的分析物的保留時間會(hui) 縮短，帶同樣電荷的會(hui) 延長。正相色譜的保留時間對流動相中的極性成分非常敏感，任何情況下水都是一個(ge) 麻煩，使用半飽和水的非極性溶劑比如正己烷和二氯甲烷來避免這個(ge) 問題。

3、鍵合相流失

對於(yu) 常用矽膠型色譜柱，要保持流動相pH2~8之間；對於(yu) *pH（>10）或極低pH（<2）的工作，使用高穩定性固定相，聚合物或高穩定性固定相柱。

4、矽膠填料的活化位點

使用流動相改性劑;流動相中加競爭(zheng) 堿;固定相用更高覆蓋度的填充料。

5、溫度降低

控製柱溫。通常溫度每變化1℃保留時間變化1%-2%。一般情況下影響沒有那麽(me) 大，顯然這種問題用柱溫箱就可以避免。

1、色譜柱填料的活性位點

使用流動相改性劑，競爭(zheng) 堿（堿性化合物，如三乙胺）或增加緩衝(chong) 液強度，使用高覆蓋率的柱填料。

2、流動相組成改變

檢查係統是否有漏液點；排除係統氣泡；補足溶劑瓶；確保梯度係統比例正確；預混合流動相進行等梯度洗脫。

3、樣品過載 

減少樣品量或使用較大內(nei) 徑或更長的色譜柱。

4、鍵合相或矽膠基流失 

使用溫和pH的流動相；使用耐受高pH或低pH專(zhuan) 用矽膠柱，聚合物柱或其它高/低pH柱。

5、 色譜柱老化

使用保護柱，或高穩定性鍵合相聚合物、混合型或高穩定性柱。

1、液相係統沒有平衡好，柱子裏的流動相一直在變化，導致基線波動；

2、沒有脫氣機的儀(yi) 器，當流動相未脫氣或脫氣未*時，基線會(hui) 出現尖刺峰；

3、當色譜柱被汙染時，也會(hui) 造成基線波動；

4、檢測器的流通池被汙染，造成吸收的不恒定，此時需要清洗流通池；

5、檢測器燈能量不足時，吸收會(hui) 變得不穩定，這時基線一般也不穩定，特別是在低波長處尤為(wei) 明顯；

6、當使用低波長檢測時，有時流動相會(hui) 使用兩(liang) 相或以上的等度，這時混合器的很小的混合比例的誤差都會(hui) 被放大，很有可能會(hui) 使基線發生波動；

7、流動相裏的有機相的截止波長最好要小於(yu) 檢測波長20nm以上；

8、實驗室環境不穩定（比如溫度忽高忽低，氣流不斷變化等）；

9、儀(yi) 器出現問題也會(hui) 造成基線波動，這種情況下通常也會(hui) 出現壓力不穩。比如流動相過濾頭堵塞、入口主動閥濾芯汙染、單向閥被汙染物堵塞、泵頭有氣泡、係統流路漏液，比如管路裂開、peek接頭沒*連上色譜柱而導致的泄露等。

色譜柱使用壽命大約為(wei) 1000針，而保護柱的壽命大約為(wei) 280針。主要受色譜條件及保存條件影響。表現形式：柱壓升高、柱效降低、峰形拖尾、峰形變寬、保留時間發生變化、固定相流失等。

1、色譜條件，有兩(liang) 種基本情況：

（1）在相同實驗中，以前使用的色譜柱壽命長很多，這種情況，應該檢查一下色譜條件是否保持一致。樣品的組成，樣品中強吸收的汙染物會(hui) 破壞色譜柱的柱效。或者管路的密封圈是否完好？脫落的密封圈會(hui) 堵塞色譜柱過濾器和填料的頂層，從(cong) 而影響樣品的分布。如果可以確認色譜條件沒有變化，那麽(me) 可以推測是柱床鬆動的原因。在實驗室和運輸過程中色譜柱劇烈的震動都會(hui) 導致柱床鬆動；

（2）在本實驗中用過的所有的色譜柱在使用相同次數後全部損壞，最大可能是樣品中的成分吸附在色譜柱的頂端。可能是在流動相中不溶的沉澱物或者是強吸收的物質；

（3）采用合適的樣品準備技術處理樣品。用和分析柱相似的固相萃取柱進行固相萃取（SPE）；

（4）使用保護柱。保護柱是作為(wei) 犧牲柱裝在色譜柱前使用的，出現問題的時候就會(hui) 被替換掉。保護柱的填料和裝填技術必須和分析柱一樣；

（5）反衝(chong) 柱子。反現在的裝填技術可以使柱子承受反衝(chong) ，能更好的去除柱頭端的汙染物。

2、使用方法不對，按照生產(chan) 商的說明使用柱子的話一般很少發生

（1）流動相pH超出使用範圍，導致的柱子鍵和相水解或基質溶解。樣品用強酸或強堿溶解的話也會(hui) 發生；

（2）高溫也會(hui) 導致色譜柱損壞，如高溫會(hui) 加速鍵合相溶解；

（3）特殊柱子注意事項，例如氨基柱可以和醛，酮反應。氨基柱在不含緩衝(chong) 鹽的水溶液中會(hui) 顯強堿性，分解部分矽膠；

（4）暴露在錯誤溶劑中的柱子也會(hui) 發生坍塌。因為(wei) 這些柱子是基於(yu) 非常鬆散的結構。他們(men) 是因顆粒之間的黏著而部分的結合在一起的。如果置於(yu) 能破化這種黏著的流動相中，柱床很有可能會(hui) 坍塌。氰基柱在中性溶液，苯基柱在THF中有時就會(hui) 發生這種問題。這也是不要衝(chong) 洗柱子的另一個(ge) 理由。 

1、色譜柱汙染

在開始時沒問題，在使用一段時間後出現這個(ge) 問題，可能是由於(yu) 汙染引起的。這時需要對色譜柱加強衝(chong) 洗，即使用比方法流動相更強的溶劑衝(chong) 洗色譜柱。

2、保護柱失效

如果樣品基質比較髒，使用一段時間之後，發現的峰分叉或拖尾等問題，很有可能是保護柱失效造成的。一般粗略判斷標準，塔板數、壓力或分離度的改變超過10%，就需要更換保護柱了。保護柱是消耗品，建議直接更換，不需要再生。

3、接頭連接不正確

如果色譜柱在使用過程中發現每個(ge) 峰的峰形都出現問題，先考察是否有連接問題。管線可能太長或太短，這種情況可能導致滲漏或峰分叉/拖尾。如果管線太長，密封圈位置不當，將發生滲漏。如果管線推出的距離不夠，將會(hui) 產(chan) 生一段死空間，形成混合腔，導致柱外體(ti) 積，使峰形變壞。

4、溶劑效應

在反相LC中、如使用100%有機溶劑或100%強溶劑，大體(ti) 積進樣時，將使色譜峰過早洗脫出色譜柱，導致峰變形。進樣溶劑改為(wei) 用水稀釋，與(yu) 流動相更為(wei) 兼容，即使進樣體(ti) 積較大也不會(hui) 出現峰變形。較早流出的峰或靠近溶劑前沿的峰更容易出現拖尾。在液相色譜中用溶於(yu) 流動相的小體(ti) 積進樣最為(wei) 理想。

5、樣品過載

當進樣量超過柱子的容量，樣品峰會(hui) 呈現分叉或拖尾，解決(jue) 方案就是減少進樣量。

6、色譜柱塌陷

由於(yu) 柱塌陷引起的峰分叉，很難修複。如果流動相pH>7或在色譜柱pH耐受圍臨(lin) 界點附近長時間使用，是比較容易造成矽膠填料溶解塌陷。如果出現色譜柱塌陷，您會(hui) 看到色譜圖中的每個(ge) 峰峰形都會(hui) 發生變化（峰拖尾、加寬或分叉），短時間內(nei) 可以反方向運行，建議直接更換色譜柱。日常使用的過程中注意將溫度降低到40℃以下，特別是使用高pH流動相時。

7、柱前篩板部分堵塞長期分析髒樣品

如果沒有保護柱或在線柱前過濾器，顆粒物和強吸附物很可能在柱入口篩板發生堵塞，同時伴隨著壓力升高，解決(jue) 辦法一般是色譜柱反衝(chong) 。

8、色譜柱性能下降

使用色譜柱時，會(hui) 用其分析各種目標物、使用各種流動相並分離不同的樣品基質，經過長時間的使用，色譜柱會(hui) 受到這些物質的影響發生一些微妙的變化，從(cong) 而引起峰分叉、拖尾或保留時間的改變。