液相色譜峰形與“溶劑效應”剪不斷理還亂的相愛相殺

此前，為(wei) 大家簡述了氣相色譜中的“溶劑效應。而高效液相色譜分析作為(wei) 現代藥物分析的重要手段，在日常實驗中，分析工作者通常將注意力集中在流動相和色譜柱以及儀(yi) 器方法的選擇上。故而當出現異常峰形時，分析工作者往往會(hui) 忽略溶解樣品所用的溶劑不恰當也是成因之一。所以一招“借刀殺人”，就讓各種色譜耗材為(wei) 不合適的溶劑背了鍋。

溶劑效應的概念

通常情況下我們(men) 認為(wei) 的“溶劑效應”是樣品溶劑強度大於(yu) 流動相強度時造成的色譜峰變形的現象。但我們(men) 會(hui) 發現，有時我們(men) 的樣品溶劑的強度並未大於(yu) 流動相，但由於(yu) 加入了某些稀釋劑，使得峰形變形情況依舊出現。因此廣義(yi) 上對“溶劑效應”的概念應擴展為(wei) 由於(yu) 樣品中某些組分在稀釋劑與(yu) 流動相中的存在狀態有較大差異，導致色譜行為(wei) 表現異常的情況。

溶劑效應的成因

01 溶劑強度

這便是普遍意義(yi) 上的“溶劑效應”成因，如當流動相組成為(wei) 低比例的乙腈水溶液，而樣品溶劑為(wei) 純乙腈時，會(hui) 由於(yu) 溶劑的強度大於(yu) 流動相而產(chan) 生峰分叉或峰拖尾。

02 進樣體(ti) 積

當進樣體(ti) 積較小時，擴散至流動相中的溶質占大多數，且擴散在很短時間內(nei) 完成，因此峰形與(yu) 用流動相直接溶解樣品無大差異。隨著進樣的體(ti) 積增大，留在溶劑本身裏的溶質的量逐漸增大，當進樣體(ti) 積增大到一定數量，留在溶劑裏的溶質的量變得不可忽略，在色譜圖上就表現為(wei) 色譜峰的分叉、拖尾等。

03 溶劑兼容性

有時，當我們(men) 使用流動相或流動相中的有機相無法直接溶解樣品，這時很多小夥(huo) 伴會(hui) 選擇使用氯仿、甲苯等能溶的溶劑，甚至DMSO這樣的“萬(wan) 能溶劑”來溶解樣品。這樣進樣的結果是溶劑與(yu) 流動相不兼容，溶質難以在流動相中擴散。又如，在做參比製劑的溶出曲線中，溶媒中經常加入表麵活性劑。而帶有表麵活性劑的溶劑進樣後，由於(yu) 溶質在含有表麵活性劑的溶劑中的分配係數與(yu) 在流動相中的分配係數存在較大差異，就會(hui) 導致峰形的問題，甚至保留時間的漂移。

04 電離狀態

電離狀態的差異主要由溶劑和流動相各自的pH差異引起。我們(men) 都知道，在反相體(ti) 係中，目標化合物的存在狀態不同，保留行為(wei) 會(hui) 有明顯的差異，而存在狀態就取決(jue) 於(yu) 目標化合物在不同pH體(ti) 係內(nei) 的電離狀態。若樣品在溶劑和流動相中電離狀態差異較大，樣品溶液在接觸流動相的過程中，來不及緩衝(chong) 至流動相中的電離狀態，是個(ge) 時間如果較長，就容易表現為(wei) 保留時間發生錯位或峰形變形，如下圖的案例。

（流動相為(wei) pH 3.0緩衝(chong) 鹽。綠色譜圖為(wei) 對照品，另外三個(ge) 譜圖樣品的溶劑從(cong) 下至上分別為(wei) 0.1%磷酸、純化水、pH 3.0流動相）

溶劑效應的解決(jue)

01 溶劑強度

對於(yu) 這一Z普遍的溶劑效應，解決(jue) 辦法即調整稀釋劑或流動相，使二者洗脫能力接近，或稀釋劑洗脫能力稍低於(yu) 流動相都是可以的。一般情況下，為(wei) 避免溶劑強度差異導致的溶劑效應，反相色譜中較為(wei) 穩妥的做法是稀釋劑中有機相比例和流動相相當，必要時可略高於(yu) 流動相，但應當據其評估其溶劑效應風險。

02 進樣體(ti) 積

常規情況下，為(wei) 了保證峰形，我們(men) 的進樣體(ti) 積都控製在5-20μL，盡量不要超過25μL。如果不能做到減少至合適的進樣體(ti) 積，為(wei) 了得到較好的峰形，應盡量選擇與(yu) 流動相比例相同或接近的溶劑。

03 溶劑兼容性

使得溶劑與(yu) 流動相能較好地兼容，目前辦法有兩(liang) 個(ge) ：

一、若流動相或流動相中的有機相無法直接溶解樣品，則用可以溶解樣品的溶劑溶解成高濃度儲(chu) 備液，然後用流動相稀釋至所需濃度；

二、在流動相中加入同樣的助溶劑或表麵活性劑，或提高有機相的比例。

04 電離狀態

電離狀態的差異許多情況下會(hui) 表現為(wei) 保留時間的漂移或不穩定。可以通過將樣品溶液的pH調節至與(yu) 流動相一致，或增大流動相的緩衝(chong) 能力來改善。

以上便是小編為(wei) 大家總結的高效液相色譜“溶劑效應”的原理及解決(jue) 辦法。高效液相色譜進樣前，必須選擇一種合適的溶劑體(ti) 係。若溶劑選擇不當會(hui) 使得峰形發生不同程度的異常，進而影響分析結果。