Ni Tanrose 6FF（NTA）親(qin) 和介質是將金屬離子Ni2+螯合在以氨三乙酸（NTA）為(wei) 配基的瓊脂糖凝膠上形成的親(qin) 和層析介質，較 IDA 結合Ni2+牢固一些。具有吸附量大、選擇好、易於(yu) 再生、成本低等特點，廣泛用於(yu) 生物製藥和生物工程下遊蛋白質和多肽的分離純化，尤其是組氨酸標簽蛋白質的高效純化。
Ni Tanrose 6FF（IDA）親(qin) 和介質是將金屬離子Ni2+螯合在以亞(ya) 氨基二乙酸（IDA）為(wei) 配基的瓊脂糖凝膠上形成的親(qin) 和層析介質，是一種非常悠久的Ni2+親(qin) 和填料，由於(yu) Ni2+與(yu) 配基鼇合鍵較少，容易受到小分子的攻擊而使Ni2+容易脫落，但其載量也相對較高。
以下是使用NTA/IDA填料可能會(hui) 出現的問題及解決(jue) 方法：
01 通過His標簽純化的蛋白，雜質比較多應當怎麽(me) 做？
①可能原因：蛋白酶會(hui) 降解部分目的蛋白。
解決(jue) 方法：加入多種蛋白酶抑製劑改進。
②可能原因：雜質蛋白與(yu) 鎳柱親(qin) 和力強。
解決(jue) 方法：可提高雜質蛋白與(yu) 鎳柱結合起始咪唑濃度。
③可能原因：雜蛋白和目的蛋白結合。
解決(jue) 方法：可通過超聲前加入去垢劑或者還原劑消除（1%-2% Triton X-100）。
④可能原因：洗滌不充分。
解決(jue) 方法：增加洗滌的次數，充分洗滌。
02 標簽蛋白不與(yu) 金屬螯合親(qin) 和層析柱結合應當怎麽(me) 做？
①可能原因：超聲的功率不對（功率太大會(hui) 導致蛋白炭化，功率太小會(hui) 導致蛋白沒有釋放）。
解決(jue) 方法：改變超聲功率或超聲前嚐試添加溶菌酶增加細胞破碎率。
②可能原因：組氨酸標簽暴露不完Q。
解決(jue) 方法：在變性條件下（4-8M脲或4-6M鹽酸胍）進行純化，此時Ni-6FF（IDA）中鎳離子容易脫落，可選擇耐受變性劑的螯合填料，如月旭科技的親(qin) 和填料Ni Tanrose 6FF（NTA）。
③可能原因：His標簽丟(diu) 失。
解決(jue) 方法：WB檢查His-tag是否表達，上遊構建，改變His-tag的位置（C-端或N-端），必要時增加標簽個(ge) 數；孵育的時間不夠，降低流速和增加孵育的時間。
03 用幾次後鎳柱載量下降、掛柱效率低，應該怎麽(me) 做？
可能原因：
逐漸積累沉澱，變性或非特異結合的蛋白占據了有效的結合位點，並且通過洗脫液無法*清洗所致。
解決(jue) 方法：
較溫和的清洗方式：用2倍柱體(ti) 積的6M鹽酸胍或8M尿素洗滌，然後用5倍體(ti) 積的緩衝(chong) 液洗滌，以去除沉澱或變性物質，接著用2倍柱體(ti) 積的1% Triton X-100洗滌，然後用5倍柱體(ti) 積的緩衝(chong) 液洗滌，以去除疏水結合的物質。若改變不明顯，可選擇強烈清洗方式。
強烈清洗方式：首先用5-10倍柱體(ti) 積的脫鎳緩衝(chong) 液（20 mM 磷酸鈉，0.5 M NaCl,，50 mM EDTA，pH 7.4）洗滌，進行脫鎳操作，然後用5-10倍柱體(ti) 積的平衡緩衝(chong) 液衝(chong) 洗，最後用5-10倍柱體(ti) 積的雙蒸水衝(chong) 洗；隨後進行清洗操作，去除離子型雜蛋白，可以用5倍柱體(ti) 積的1.5M NaCl溶液，然後10倍柱體(ti) 積的雙蒸水衝(chong) 洗；去除沉澱或變性蛋白，可以用1M氫氧化鈉溶液，結合1-2小時，然後用10倍柱體(ti) 積的平衡緩衝(chong) 液和10倍柱體(ti) 積的雙蒸水迚行衝(chong) 洗；去除疏水蛋白或者脂蛋白，可以用5-10倍柱體(ti) 積的30%異丙醇溶液清洗，然後10倍柱體(ti) 積的雙蒸水洗滌；最後進行生鎳操作，用0.1M硫酸鎳上柱，隨後5倍柱體(ti) 積的雙蒸水和平衡緩衝(chong) 液迚行洗滌。如需保存，保存在20%乙醇溶液。
04 簽蛋白結合在填料上洗脫不下來，應該怎麽(me) 做？
①可能原因：洗脫條件太溫和（標簽蛋白仍然結合在柱上，結合力較強）。
解決(jue) 方法：增加咪唑的梯度洗脫或降低pH 來找出最佳的洗脫條件。
②可能原因：降低pH的方法洗脫，若pH低於(yu) 3.5，會(hui) 導致鎳離子脫落。
解決(jue) 方法：改變洗脫辦法，如咪唑競爭(zheng) 性洗脫。
③可能原因：蛋白已沉澱在柱上。
解決(jue) 方法：1.減少上樣量，或使用咪唑的線性梯度而不是分步洗脫以降低蛋白的濃度。試用去汙劑或改變NaCl的濃度，或在變性條件（去折疊）下洗脫（用4-8 M脲，或4-6 M鹽酸胍）；2.蛋白在柱上變性固化，用0.5M氫氧化鈉洗柱。
④可能原因：非特異性疏水或其他相互作用。
解決(jue) 方法：加非離子去汙劑到洗脫緩衝(chong) 液（如：2% Triton X-100）或增加NaCl的濃度。
⑤可能原因：在填料表麵形成高密度融合蛋白的聚集。
解決(jue) 方法：選擇合適載量的填料，切勿一味追求高載量。
05 柱使用過程中發現堵塞嚴(yan) 重，且流速越來越慢應該怎麽(me) 做？
可能原因：
樣品中細胞碎片或其他雜顆粒所致。
解決(jue) 方法：
樣品處理過程中，高速離心，推薦用0.45um的濾膜過濾。如果柱子堵塞嚴(yan) 重，重生時使用1% Triton X-100/PBS浸泡過夜。流速慢，可在柱子下麵接一根軟管。
06 鎳柱使用過程中出現棕色應該怎麽(me) 做？
可能原因：
緩衝(chong) 液中DTT的影響，DTT會(hui) 對鎳柱的顏色和純化效率有很大的影響，在堿性的緩衝(chong) 液條件下，鎳離子會(hui) 被DTT還原生成棕色的沉澱，所以要盡量避免DTT的參與(yu) 。
解決(jue) 方法：
若樣品中含有DTT，在上樣之前, 我們(men) 推薦采用不含還原性試劑的空白運行來除去任何較弱結合的鎳離子。
空白運行方法（使用不含還原劑的平衡液和洗脫液）：
1）5倍柱體(ti) 積的雙蒸水洗柱；
2）5倍柱體(ti) 積的平衡液洗柱；
3）5倍柱體(ti) 積的洗脫液洗柱；
4）10倍柱體(ti) 積的平衡液平衡。
當不使用時，勿將Ni Tanrose 6FF（IDA）保存於(yu) 含還原性試劑的緩衝(chong) 液中。
