隨著蛋白質化學和分子生物學的發展，用於(yu) 各種疾病治療的蛋白質類藥物的研製和應用已成為(wei) 生物醫藥產(chan) 業(ye) 發展的熱點。多肽和蛋白類藥物副作用小、活性強，並具有標本兼治的功效。當我們(men) 純化蛋白時，最重要的就是要保持蛋白在純化過程中不能失活，或者是盡量降低純化過程對蛋白活性帶來的損失。因此，在設計緩衝(chong) 液時應考慮以下幾個(ge) 因素：pH值、緩衝(chong) 體(ti) 係、鹽離子、還原劑和穩定劑。
pH值
很多實驗的pH值設定在7.4以模仿生物條件，但如果目的蛋白在此條件下不穩定，就需要改變pH值使它在溶液中處於(yu) 可溶且不會(hui) 降解的狀態。當溶液pH值在蛋白等電點pI附近時，其在溶液中會(hui) 表現得不易溶解，因為(wei) 此時蛋白表麵沒有淨電荷，從(cong) 而容易聚集。可以用ExPASy網站的ProtParam工具快速簡便地計算蛋白等電點pI值，隻要提交蛋白序列即可。
緩衝(chong) 體(ti) 係
首先我們(men) 要確保所選擇的緩衝(chong) 體(ti) 係在設定的pH值上確實具有緩衝(chong) 能力，其解離常數pKa值應該在所設定的pH值上下一個(ge) 單位內(nei) 。
再者是確保緩衝(chong) 液濃度足夠高以達到實際緩衝(chong) 溶液的作用。一般會(hui) 選擇的濃度是20~100mM。需要注意的是所使用的緩衝(chong) 體(ti) 係不能影響蛋白活性，比如磷酸鹽會(hui) 抑製激酶的活性，所以反應前應*地透析掉。
此外，一些緩衝(chong) 體(ti) 係對溫度非常敏感，例如Tris-HCl緩衝(chong) 液，如果在25℃時將緩衝(chong) 體(ti) 係調至pH值8，其pH值將在5℃時增加到8.58，在37℃時降到7.71，所以，如果不是在25℃下進行實驗，就應該考慮到這個(ge) pH值可能在實驗條件中不適用。
鹽離子
許多緩衝(chong) 液中含有NaCl，以幫助保持蛋白的可溶性和模擬生理條件，濃度一般為(wei) 150mM，但在不同的蛋白純化步驟中，可能需要不同的鹽離子濃度。離子交換層析一般是低鹽結合、高鹽洗脫，結合時需要降低鹽濃度是為(wei) 了避免高離子強度下，鹽離子與(yu) 蛋白競爭(zheng) 與(yu) 填料結合，防止蛋白從(cong) 離子交換柱中流穿，從(cong) 而使柱子能夠結合目的蛋白；而疏水層析一般為(wei) 高鹽結合、低鹽洗脫。
還原劑
如果目標蛋白含有半胱氨酸殘基，可能會(hui) 出現殘基間的氧化問題，並可能導致蛋白聚集。為(wei) 了防止這一點，往往會(hui) 在緩衝(chong) 液中添加一些還原劑，如DTT、TCEP和巰基乙醇。
TCEP是這三個(ge) 還原劑中z穩定的，但也是最貴的。通常純化過程中的緩衝(chong) 液裏會(hui) 添加DTT，在最後保存酶液的緩衝(chong) 液裏添加TCEP。還原劑濃度一般是5~10mM，它應遠遠高於(yu) 蛋白濃度。DTT和巰基乙醇在室溫下就會(hui) 降解，所以需要將添加了還原劑的緩衝(chong) 液處於(yu) 低溫保藏，或者在使用時再添加還原劑。
使用還原劑時要確保柱材料能夠與(yu) 之相容，比如高濃度的還原劑會(hui) 脫掉鎳柱中的鎳，並使柱子顏色變深呈棕色，雖然鎳柱能進行再生，但柱載量將會(hui) 受到很大影響。
穩定劑
添加一些穩定劑到緩衝(chong) 液中，能幫助提高蛋白純化時的蛋白溶解度和穩定性。在緩衝(chong) 液中添加惰性蛋白BSA在某種程度上可以穩定目標蛋白，但必須確保這些加入的穩定劑不幹擾實驗；有時添加甘油、聚乙二醇等以增加緩衝(chong) 液粘度，有助於(yu) 防止蛋白聚集；另外，使用少量的表麵活性劑和一些離子化合物如硫酸鹽、氨基酸、檸檬酸等可以避免蛋白間的離子相互作用，幫助蛋白溶解。
以上就是在設計緩衝(chong) 液時應該考慮的五個(ge) 因素，為(wei) 了保持蛋白在純化過程中的活性和穩定性，我們(men) 應當設定最佳實驗方案。
