液相色譜，你問我答（二）

#1 色譜柱的技術都有哪些？比如，封尾等，這些技術在應用時都體(ti) 現在哪裏？

答：色譜柱技術包括填料技術，封尾技術和裝柱技術等，填料技術自不待言，填料的差異對色譜柱分離性能和選擇性有決(jue) 定性影響，色譜填料的鍵合相密度的不同也會(hui) 影響到填料表麵矽羥基裸露的多少，進而影響填料的選擇性。封尾技術中用到的封尾試劑的差異也會(hui) 對色譜柱的性質產(chan) 生很大的影響，如體(ti) 現在色譜填料的pH耐受範圍，水相耐受範圍，極性強弱等。裝柱技術也沒有想象中的這麽(me) 簡單，不同固定相、不同粒徑、不同柱管內(nei) 徑和長度，裝柱工藝都有所不同，要裝出緊密、穩定、均一的柱床，更多是一門藝術，需要經驗積累。

#2 柱子在什麽(me) 情況下需要更換篩板呢？更換篩板會(hui) 使色譜柱使用壽命減少嗎？

答：色譜柱篩板被樣品汙染，或被柱頭端填料汙染了，就需要更換篩板，並且更換柱頭端被汙染的填料。月旭科技不建議客戶自行拆開色譜柱柱頭螺絲(si) ，最好是寄回廠家維修。色譜柱更換篩板和柱頭填料不會(hui) 對色譜柱使用壽命造成影響。

#3 如果柱子取下來放置一段時間，需要做什麽(me) 保護嗎？

答：對一般的反相柱，也就是洗幹淨後置於(yu) 純甲醇（乙腈）或者是80%左右的甲醇（乙腈）水中，然後用堵頭塞緊柱兩(liang) 頭，以免保存溶劑揮發，下次使用前拿出來重新活化一下。

#4 做實驗，是用保護柱好？還是不用保護柱好？

答：應該這樣說，加上保護柱，肯定有利於(yu) 保護色譜柱不受一些顆粒物質的堵塞，且如果保護柱接得好並且盡量控製其匹配性和經常更換，對分離度和柱效的影響並不大。隻是在選擇保護柱柱芯時千萬(wan) 注意，選擇和分析柱填料相一致的保護柱柱芯，否則極有可能影響化合物的分析。

#5 用的是四元梯度泵：A：50%甲醇；B：50%水，經常出現停或進氣泡這是什麽(me) 原因？

答：水/甲醇比例在55/45時，黏度和柱壓有個(ge) 極大值。50/50接近了這個(ge) 極值，柱壓是比較高的。但影響柱壓最大的還是填料粒徑和色譜柱內(nei) 徑。係統壓力高，可能會(hui) 因溶劑泵中的過濾頭供液速度跟不上而導致氣泡進入係統，停機也應該是因為(wei) 氣泡進入壓力下降的原因，可考慮更換液體(ti) 通量更大的過濾頭。

#6 填料方法的前三種都是濕法嗎，能不能對四種填充方法做一個(ge) 簡短的說明？

答：資料顯示：在正常條件下，填料粒度＞20µm時，幹法填充製備柱較為(wei) 合適；顆粒＜20µm時，濕法填充較為(wei) 理想。填充方法一般有4種：

① 高壓勻漿法，多用於(yu) 分析柱和小規模製備柱的填充；

② 徑向加壓法，Waters專(zhuan) L；

③ 軸向加壓法，主要用於(yu) 裝填大直徑柱，如DAC；

④ 幹法柱填充的技術性很強，大多數實驗室使用已填充好的商品柱。

#7 如果不使用不鏽鋼接頭，而改用peek頭，是否可以完Q解決(jue) 接頭匹配問題？

答：色譜柱接頭其實大都不是色譜柱廠商自己生產(chan) 的，供貨商有多個(ge) ，Valco，Parker等，他們(men) 的標準相互之間不統一，那色譜柱接頭的標準就統一不起來。不過一般這個(ge) 問題也不難解決(jue) 的，換個(ge) 接頭就可以了，而且現在有了萬(wan) 用接頭，可以配所有不同類型的柱頭，不泄露，連接死體(ti) 積又很小。

#8 做多肽藥物時，流動相A：0.1%或者1%TFA水溶液，流動相B：0.1%或者1%TFA乙腈溶液，基線波動大，流動相中不加TFA時見不到主峰，基線良好。

答：很明顯這是TFA加入流動相裏，走梯度情況下造成的基線波動。TFA優(you) 於(yu) 其他離子修飾劑的原因是它容易揮發，可以方便地從(cong) 製備樣品中除去。另一方麵，TFA的紫外最大吸收峰低於(yu) 200nm，因此在低波長下容易出現基線幹擾。解決(jue) 辦法可以建議在其中一瓶流動相中等比例加入另一瓶流動相的溶液。

#9 三lv乙酸流動相使用完之後如何衝(chong) 洗色譜柱比較好？

答：流動相加入TFA，在反相色譜分離多肽和蛋白質的實驗中，使用TFA作為(wei) 離子對試劑是常見的手段。流動相中的TFA通過與(yu) 疏水鍵合相和殘留的極性表麵以多種模式相互作用，來改善峰形、克服峰展寬和拖尾問題。因為(wei) TFA也屬於(yu) 一種離子對試劑，因此最好也使用衝(chong) 洗離子對試劑的步驟衝(chong) 洗色譜柱，即50%甲醇水低流速反衝(chong) 過夜。若是分析蛋白樣品，建議按照10%甲醇--乙腈/水/TFA (50/50/0.1)，低流速反衝(chong) 過夜。

#10 藥典上介紹測定分子量大於(yu) 2000的樣品，選擇柱子填料的孔徑為(wei) 300Å，300Å與(yu) 100Å對結果有什麽(me) 區別？

答：在做多肽類樣品的時候，300Å孔徑的填料相對100Å孔徑肯定要選擇性好點，也就是分離度相對比較好點。因為(wei) 蛋白分子量＞2000，會(hui) 對進入120Å填料的孔造成困難，從(cong) 而進不了孔，沒有保留，就在填料表麵，隨著溶劑一同出峰。我們(men) 一般選擇填料的時候，要求孔徑至少是分子直徑的三倍，從(cong) 而保證分子可以進入到孔內(nei) 。