分子排阻色譜探究竟

分子排阻色譜，有時又叫“尺寸排阻色譜”或“體(ti) 積排阻色譜”，是根據待測組分的分子大小進行分離的一種液相色譜技術。

分子排阻色譜法的分離原理為(wei) 分子篩機製，色譜柱多以親(qin) 水矽膠、凝膠或經過修飾的凝膠，如葡聚糖凝膠和瓊脂糖凝膠等為(wei) 填充劑，這些填充劑表麵分布著不同孔徑尺寸的孔。分子進入色譜柱後，它們(men) 中的不同組分按其分子大小進入相應的孔內(nei) ，大於(yu) 所有孔徑的分子不能進入填充劑顆粒內(nei) 部，在色譜過程中不被保留，早被流動相洗脫至柱外，表現為(wei) 保留時間較短；小於(yu) 所有孔徑的分子能自由進入填充劑表麵的所有孔徑，在色譜柱中滯留時間較長，表現為(wei) 保留時間較長；其餘(yu) 分子則按分子大小依次被洗脫，如下圖。

不同分子的物質的分子排阻洗脫示意圖

雖說分子排阻色譜的流動相和反相色譜的流動相很相似，但其分離機理卻是相差甚遠。下表為(wei) 大家列出了兩(liang) 種分離模式的異同：

那麽(me) 分子排阻色譜在使用過程中究竟有哪些特別之處，今天就來一探究竟吧。

01 固定相

葡聚糖凝膠或瓊脂糖凝膠聚合物基質的填充劑做固定相時，要千萬(wan) 注意流動相和樣品中不可以出現任何有機溶劑，否則極易導致基質破碎。如《中國藥典》中規定的頭孢類聚合物的檢測方法：

《中國藥典》2020版頭孢類化合物聚合物測定

親(qin) 水矽膠多為(wei) 表麵鍵合親(qin) 水薄膜的高純矽膠，具有良好穩定性和批次重現性。如月旭科技Xtimate® SEC填充劑采用*的化學鍵合技術，在矽膠表麵鍵合親(qin) 水性聚合物以及親(qin) 水性二醇基團（如下圖）：

雙重鍵合機製使水溶性高分子聚合物蛋白、生物酶、多肽等生物樣品的非特異性吸附極小，因而可廣泛應用於(yu) 水溶性聚合物及生物大分子的分離和測定。

親(qin) 水矽膠填料還有一個(ge) 顯著特點，就是會(hui) 有眾(zhong) 多孔徑選擇，以適合不同分子量大小的高分子化合物的分離。通常情況下，120Å、200Å和300Å的孔徑可適合大多數多肽、蛋白等高聚物的分子量分離，更大分子量的高聚物則要選擇更大孔徑的填料。

02 流動相

分子排阻色譜根據流動相的水溶性，分為(wei) 凝膠過濾（GFC），凝膠滲透（GPC）。親(qin) 水矽膠填充劑做固定相時，流動相多為(wei) 上述水溶性溶劑，常稱作凝膠過濾（GFC或SEC）。而凝膠滲透的流動相多為(wei) 脂溶性溶劑，如《中國藥典》22種有機氯的供試品前處理GPC步驟：

《中國藥典》2020版通則2341d一法22種有機氯類農(nong) 藥殘留量測定法

03 方法開發

在使用月旭科技Xtimate SEC色譜柱進行分子量分布的方法開發中，有以下因素可能影響分離效果：

分子量

可根據目標物的分子量，來選擇合適孔徑的色譜柱。

樣品與(yu) 流動相

為(wei) 避免色譜柱堵塞，所有樣品和溶劑，包括緩衝(chong) 鹽，都必須在使用前用0.45μm或0.22μm濾膜過濾。Xtimate SEC可以使用水或有機溶劑與(yu) 水的混合物，與(yu) 大多數緩衝(chong) 鹽溶液也兼容。流動相使用前需脫氣，否則可能出現柱壓和基線波動較大。這時可用較大流速衝(chong) 洗色譜柱2-5min，如對於(yu) 7.8*300mm的色譜柱，可用1.25 mL/min的流速。

離子強度

色譜柱中不可避免會(hui) 存在其他次級作用力，為(wei) 了大限度降低填料與(yu) 被測物的次級作用力，必須調整流動相的離子強度。NaCl是SEC分離中比較常用的鹽，可通過調整離子強度，減少次級作用力，進而改善峰形和分離效果。

pH

流動相的pH調整，更多也是為(wei) 了減少色譜柱中的次級作用對被測物的影響，所以測定過程中需選擇合適的pH。為(wei) 獲得z佳分離效果和延長使用壽命，建議使用pH在 2-7.5 範圍內(nei) 的流動相。

流速

盡量采用低流速測試，可以提高分離度，進而獲得更好的測試效果。內(nei) 徑為(wei) 4.6mm 和 7.8mm 的色譜柱，一般建議其正常操作流速分別為(wei) 0.1-0.4 和 0.1-1.25 mL/min。

柱長

通過增加色譜柱的長度可以改善SEC分離度，所以在分離過程中，在一根色譜柱達不到分離效果時，可以考慮兩(liang) 根色譜柱串聯，甚至不同孔徑的色譜柱串聯（注：一般大孔徑的在前，小孔徑的在後）。這種條件下通常也會(hui) 造成出峰時間延後，及係統壓力增加。

柱溫

z高操作溫度為(wei) 80℃。為(wei) 了獲得長的使用時間，z佳操作溫度為(wei) 10-30℃。長時間在高溫（>80℃）下操作也會(hui) 損壞色譜柱，這種情形在高的 pH（>7.5）條件下尤其突出。

後，在使用月旭科技Xtimate SEC色譜柱過程中，注意盡管Xtimate SEC可在高至2000psi 的壓力下使用，但正常的操作壓力應當低於(yu) 1500 psi。長時間在高壓下運行會(hui) 損壞色譜柱和輸液泵。由於(yu) 壓力來源於(yu) 流速，因此大流速將受製於(yu) 係統所能承受的壓力。一般而言，柱壓會(hui) 隨著色譜柱使用時間的增加而逐漸增加。Xtimate SEC色譜柱日常使用完後衝(chong) 洗，建議保存在高比例的水-有機溶劑中。

月旭科技多年專(zhuan) 注於(yu) 色譜柱的研發和生產(chan) ，推出的色譜柱具有種類齊全、普適性強、峰形優(you) 異、超高柱效、批次穩定等特點。欲了解更多內(nei) 容，歡迎聯係月旭科技當地銷售同事，我們(men) 將竭誠為(wei) 您服務！