His標簽是蛋白純化中經常會(hui) 用到的標簽，但是很多小夥(huo) 伴在做蛋白純化時會(hui) 遇到各種問題，這裏小編就總結了常見的一些問題。
1. 通過His標簽純化的蛋白，雜質比較多？
可能原因1：蛋白酶會(hui) 部分降解目的蛋白
解決(jue) 方法：加入多種蛋白酶抑製劑改進。
可能原因2：雜質蛋白與(yu) 鎳柱親(qin) 和力較強
解決(jue) 方法：可提高雜質蛋白與(yu) 鎳柱結合起始咪唑濃度。
可能原因3：雜蛋白和目的蛋白結合
解決(jue) 方法：可通過超聲前加入去垢劑或者還原劑消除（1%-2%Tritonx-100）。
可能原因4：洗滌不充分
解決(jue) 方法：增加洗滌的次數，充分洗滌。
2. 融合蛋白不掛金屬螯合親(qin) 和層析柱？
可能原因1：超聲的功率不對（太大，蛋白炭化，太小，蛋白沒有釋放）
解決(jue) 方法：改變超聲功率或超聲前嚐試添加溶菌酶增加細胞破碎率。
可能原因2：組氨酸標簽暴露不*
解決(jue) 方法：在變性條件下（用4-8 M 脲，或4-6 M 鹽酸胍）進行純化，常規Ni-6FF(IDA) ，在變性條件下鎳離子容易脫落，此時可選擇耐受變性劑的螯合填料（推薦月旭材料的親(qin) 和填料Ni Tanrose FF(NTA)）。
可能原因3：His標簽丟(diu) 失
解決(jue) 方法：
1.WB 檢查His是否表達，上遊構建，改變His-tag的位置(C- 端或N- 端)，必要時增加His個(ge) 數；
2.孵育的時間不夠，降低流速和增加孵育的時間；
3.改變螯合的金屬離子，尋找到z jia的結合金屬離子；
4.選擇高載量高特異性的螯合填料（月旭材料的親(qin) 和填料 Ni Tanrose FF（IDA) )。
3. 使用幾次後Ni柱載量下降，掛柱效率低，如何處理？
可能原因：逐漸積累沉澱，變性或非特異結合的蛋白占據了有效的結合位點，而通過洗脫液無法*清洗所致
解決(jue) 方法：
較溫和的清洗方法：用2倍柱體(ti) 積的6M鹽酸胍或8M尿素洗滌，然後用5倍體(ti) 積的緩衝(chong) 液洗滌，以去除沉澱或變性物質。用2倍柱體(ti) 積的1% Triton X-100洗滌，然後用5倍柱體(ti) 積的緩衝(chong) 液洗滌，以去除疏水結合的物質。若改變不明顯，可選擇強烈清洗方式。
強烈清洗方式：首先用5-10倍柱體(ti) 積的脫鎳緩衝(chong) 液（20 mM 磷酸鈉, 0.5 M NaCl, 50 mM EDTA, pH 7.4）洗滌，進行脫鎳操作，然後用5－10倍柱體(ti) 積的平衡緩衝(chong) 液衝(chong) 洗，後用5－10倍柱體(ti) 積的雙蒸水衝(chong) 洗；隨後進行清洗操作，去除離子型雜蛋白，可以用5倍柱體(ti) 積的1.5 M NaCl溶液，然後10倍柱體(ti) 積的雙蒸水衝(chong) 洗；去除沉澱或變性蛋白，可以用1M氫氧化鈉溶液，結合1－2小時，然後用10倍柱體(ti) 積的平衡緩衝(chong) 液和10倍柱體(ti) 積的雙蒸水迚行衝(chong) 洗；去除疏水蛋白或者脂蛋白，可以用5－10倍柱體(ti) 積的30%異丙醇溶液清洗，然後10倍柱體(ti) 積的雙蒸水洗滌；後進行生鎳操作，用0.1M硫酸鎳上柱，隨後5倍柱體(ti) 積的雙蒸水和平衡緩衝(chong) 液迚行洗滌，如需保存，保存在20%乙醇溶液。
4. 融合蛋白結合在螯合填料上洗脫不下來？
可能原因1：洗脫條件太溫和（融合蛋白質仍然結合在柱上，結合力較強）
解決(jue) 方法：增加咪唑的梯度洗脫或降低pH來找出z jia的洗脫條件。
可能原因2：降低pH的方法洗脫，若pH低於(yu) 3.5，會(hui) 導致鎳離子脫落
解決(jue) 方法：改變洗脫辦法，咪唑競爭(zheng) 性洗脫。
可能原因3：蛋白已沉澱在柱上
解決(jue) 方法：
1. 減少上樣量，或使用咪唑的線性梯度而不是分步洗脫以降低蛋白的濃度。試用去汙劑或改變NaCl的濃度，或在變性條件（去折疊）下洗脫（用4-8 M 脲，或4-6 M 鹽酸胍）；
2. 蛋白在柱上變性固化，用0.5M氫氧化鈉洗柱。
可能原因4：非特異性疏水或其他相互作用
解決(jue) 方法：加非離子去汙劑到洗脫緩衝(chong) 液（如：2% Triton X-100）或增加NaCl的濃度。
可能原因5：在填料表麵形成高密度融合蛋白的聚集
解決(jue) 方法：選擇合適載量的填料，切勿一味追求高載量。
5. 使用過程中發現堵塞嚴(yan) 重，且流速越來越慢？
可能原因：樣品中細胞碎片或其他雜顆粒所致
解決(jue) 方法：樣品處理過程中，高速離心，z hao用0.45um的濾膜過濾（推薦）。如果柱子堵塞嚴(yan) 重，重生時使用1% Triton X-100/PBS浸泡過夜。流速慢，可在柱子下麵接一根軟管。
6. 鎳柱使用中出現棕色是怎麽(me) 回事？
可能原因：緩衝(chong) 液中DTT的影響， DTT會(hui) 對鎳柱的顏色和純化效率有很大的影響，在堿性的緩衝(chong) 液條件下，鎳離子會(hui) 被DTT還原生成棕色的沉澱，所以要盡量避免DTT的參與(yu)
解決(jue) 方法：若樣品中含有DTT，在上樣之前, 我們(men) 推薦采用不含還原性試劑的空白運行來除去任何較弱結合的鎳離子；空白運行方法（使用不含還原劑的平衡液和洗脫液）
1）5倍柱體(ti) 積的雙蒸水洗柱；
2）5倍柱體(ti) 積的平衡液洗柱；
3）5倍柱體(ti) 積的洗脫液洗柱；
4）10倍柱體(ti) 積的平衡液平衡。
當不使用時，勿將Ni Tanrose 6FF（IDA）保存於(yu) 含還原性試劑的緩衝(chong) 液中。
7. 上清渾濁，是用IDA好還是NTA好？
上清渾濁，推薦適當稀釋上清，並再次離心或者過0.45um濾膜處理。Ni Tanrose 6FF（IDA）或Ni Tanrose 6FF（NTA）都可純化。
8. 填料是否可以重複使用？可以使用多少次?
如果維護的好的話，填料在其效期之內(nei) 可以一直重複使用。如果每次都是純化同樣的蛋白就沒有必要剝離掉鎳離子重新掛鎳，一般經過5-7次純化之後可以進行脫鎳和再生鎳的操作。如果柱子反壓高了，填料需要做*的在位清洗CIP，在清洗之前，為(wei) 了避免金屬鹽的沉澱，需要剝離掉鎳離子，然後再重新掛鎳，清洗後保存在20％的乙醇中。填料的壽命因使用的環境，純化的樣品的特性，保存方式等都有直接關(guan) 係。
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