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反相液相色譜梯度優化大揭秘

更新時間:2020-10-23 點擊次數:6215

梯度優(you) 化在液相色譜方法開發中是非常重要的一個(ge) 環節。有時,一個(ge) 合適的梯度洗脫程序對液相色譜分析分離可起到“四兩(liang) 撥千斤”的作用。然而,許多小夥(huo) 伴由於(yu) 梯度優(you) 化實驗做得相對較少,因此誤認為(wei) 梯度優(you) 化非常複雜。今天小編就帶大家來揭開反相液相色譜梯度程序的神秘麵紗,一探梯度優(you) 化的究竟。

 

 

一、建立梯度方法的原因

Q 為(wei) 什麽(me) 要用梯度的方式來洗脫呢?

當然,作為(wei) 分析工作者,如果能以一個(ge) 等度的條件完成我們(men) 的分離目的,那便是是皆大歡喜的,但實際情況常常不能如我們(men) 所願。混合樣品組分中,必定存在容易分離和不易分離的組分,保留較弱和保留較強的組分。

我們(men) 建立梯度洗脫程序的目的就在於(yu) ,將容易分離的組分在洗脫能力較弱的流動相中實現盡快分離,而保留較強的組分在色譜柱內(nei) 停留較長時間,與(yu) 鍵合相表麵發生充分的相互作用,盡可能地彼此拉開,後用強洗脫能力的流動相洗脫出來,避免洗脫時間過長。

 

二、反相液相色譜體(ti) 係流動相的洗脫能力

Q 前文既然講到了流動相的洗脫能力,那麽(me) ,反相色譜中,如何來判斷流動相的洗脫能力呢?

我們(men) 可以來看一下下麵這張圖:

 

 

上圖各位小夥(huo) 伴應該都不陌生,所述的原理即是,在反相體(ti) 係中,隨著流動相的極性不斷增加(水相的比例在不斷增加),流動相整體(ti) 的洗脫能力逐漸減弱,而保留時間則在逐漸延長。因此,前文中對於(yu) 容易分離的組分,可嚐試在流動相極性較大的環境下將其實現分離。

 

同時,為(wei) 了提高整個(ge) 樣品混合組分的分離度,在整個(ge) 梯度程序內(nei) ,也盡可能使用高比例的水相作為(wei) 梯度洗脫的起始條件。因此,對於(yu) 很多小夥(huo) 伴,在進行一個(ge) 全新的項目的反相條件方法開發的時候,chang用的初始梯度模式便是在0~40min內(nei) ,進行一個(ge) 95%水相→100%有機相的線性洗脫。

 

三、反相液相色譜梯度優(you) 化中心思路

反相色譜梯度優(you) 化的中心思路,其實就是盡可能減弱流動相的洗脫能力,從(cong) 而減少共洗脫的情況。減弱流動相洗脫能力y效的方式是更換洗脫強度弱一些的溶劑,或者增減流動相中的添加劑。

 

然而,很多情況下,小夥(huo) 伴參照既定標準進行實驗,溶劑種類和添加劑的量不便進行過多的調整,這樣的情況下,還有一個(ge) 方法可以調節流動相的洗脫強度,那就是減緩流動相的變化斜率。我們(men) 通過下麵這個(ge) 案例給大家說明:

 

通過上圖我們(men) 可以看到,在梯度(一)條件下,多潘立酮和雜質D出現共洗脫,峰重疊。於(yu) 是我們(men) 進行梯度程序的調節:


 

在梯度(二)中,10min時乙腈的比例為(wei) 45%,而梯度(一)下10min時乙腈的比例為(wei) 60%,並且梯度(二)中的後7min,乙腈的比例也並未繼續升高至100%,這就使得梯度(二)條件中,每時每刻乙腈的比例都低於(yu) 梯度(一),暨每時每刻流動相的洗脫強度都弱於(yu) 梯度(一),如下圖。如此一來,各雜質共洗脫的情況得到改善,結果就是如圖3所示,8個(ge) 物質都得到了分離。

 

 

四、注意事項

在進行方法開發梯度優(you) 化的時候,一定要注意兼容性的問題,包括流動相溶劑彼此之間的兼容性,以及流動相和樣品的兼容性

流動相溶劑選擇上,h是選擇能夠任意比例互溶的溶劑。若是流動相溶劑不方便更換,則需盡量減緩流動相的變化速率,給有機相和水相(鹽相)更多的時間來互溶。

對於(yu) 樣品來說,流動相的性質一定要注意與(yu) 樣品溶劑能夠兼容,避免出現在進樣後的任意時刻樣品不溶解、析出的情況。

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