案例分享，手把手教你液相色譜梯度優化

各位小夥(huo) 伴在實驗分析中應該都遇到過這類問題，在液相色譜中，對於(yu) 組分複雜的樣品，采用一種色譜體(ti) 係，往往很難得到理想的分離效果，要麽(me) 分離時間太長，要麽(me) 分離度太差。這種情況，采用梯度洗脫就可以縮短分析時間，提高分離效果。下麵和大家分享一則梯度微調實例，一起感受下梯度微調對分離效果的奇妙影響吧。

1、盡量在能長時間測試該項目的儀(yi) 器上開發方法；

2、需要了解係統的性能，避免出現儀(yi) 器係統改變後不能重現的問題；

3、要知道係統的兩(liang) 個(ge) 基本情況：梯度滯後體(ti) 積和比例精確性。這可以在同一個(ge) 實驗裏得到這兩(liang) 個(ge) 數據：參考《JJG 705 2014液相色譜儀(yi) 檢定規程》中《梯度誤差》實驗：在B溶液（0.1%丙酮）後加紫外檢測器，設置一個(ge) 多階層的梯度，B溶液以5%的幅度從(cong) 0%變到100%，流速與(yu) 平常一樣，流速為(wei) 1mL/min。每段梯度大概保持5min。然後接二通運行梯度，記錄圖譜。每段梯度設置的時間與(yu) 實際發生的梯度時間之差就是梯度延遲時間，階層的高度可以用來測量流動相比例，這些階層可能有點模糊，是由係統中混合體(ti) 積造成的；

4、檢測完係統，就可以按照它的性能來設計方法。梯度方法轉換大的問題是梯度滯後體(ti) 積，如果知道儀(yi) 器的滯後體(ti) 積比初開發方法的儀(yi) 器大，就要自覺的在方法前加一段等度來抵消這一差別，如果目標係統滯後體(ti) 積小，就要在轉移方法的時候在方法開始加一段梯度延遲時間，如果比例差別是在梯度運行中間出現的，也可以通過調節梯度圖譜來抵消這種差別，但是一般很少遇到過需要這麽(me) 做的情況。

5、初始流動相沒有充分平衡。柱子已經用初始流動相平衡了，但在分析中，梯度變化很快，而柱子沒有用初始流動相充分平衡好，這樣di一針時總是與(yu) 後麵的不一樣。但是如果轉移到有不一樣滯後體(ti) 積的係統時，可能就是另一種情況。

項目背景

名稱：12種酚類

色譜柱：月旭Ultimate ® AQ-C18 4.6mm*150mm,5μm

流動相A：水   流動相B：乙腈

問題：柱子正常活化進樣，基線和整體(ti) 出峰均不理想，分離度較差。

1.柱子在運輸或儲(chu) 存過程中保存液發生變化，導致填料產(chan) 生微小改變，碳鏈蜷縮，未舒展開來，對目標物的保留造成影響；

2.儀(yi) 器係統存在梯度滯後，在梯度變化過程中，兩(liang) 相混合不精準，導致的物質分離問題；

3.目標物受溶劑效應影響；

4.梯度變化過快，流動相的洗脫能力太強，導致色譜峰未達到分離效果。

1.測試梯度滯後體(ti) 積和比例精確性；

2.用初始流動相0.2流速過夜平衡柱子；

3.樣品用初始流動相溶解（慎用，改變樣品溶劑後需要驗證樣品溶液的穩定性）；

4.調節梯度，減緩洗脫速率，減小洗脫能力；

基線和峰形大有改善，但是後一個(ge) 峰在梯度時間外出峰了。

梯度變化中，水相速率增長較快，物質保留變強，沒有獲得足夠的洗脫能力，後一個(ge) 物質出峰較晚。

前段分離好的梯度不做調整，調整後一個(ge) 物質出峰梯度階段的有機相比例，增加洗脫能力。

以上說明，項目的成功與(yu) 否，不僅(jin) 取決(jue) 於(yu) 色譜柱類型，儀(yi) 器條件，還有方法的建立。其中流動相便是考察重點，流動相梯度洗脫必要時可以充分應用上，他是由幾種不同極性的溶劑組成，通過改變流動相中不同時間段各溶劑組成的比例改變流動相極性，使每個(ge) 流出的組分都有合適的容量因子，並使樣品的所有組分在短時間內(nei) 實現佳分離。好啦，今天的分享就先到這，希望能對小夥(huo) 伴們(men) 有所啟發有所幫助哦。