不管你的極性有多強！我都會牢牢抓住你

反相色譜柱一般是由矽膠，有機/無機雜化矽膠或者聚合物作為(wei) 基質， C18作為(wei) 鍵合相。典型反相色譜柱基於(yu) 分析物與(yu) 烷烴鏈之間的疏水相互作用，根據樣品組分的極性大小的差異而實現樣品組分的分離。該分離模式有賴於(yu) 色譜柱多孔基質內(nei) 的C18鍵合相的自由伸展構象。

對於(yu) 有機酸/堿類化合物，多羥基化合物以及偶氮類等極性化合物，由於(yu) 含有羧基，氨基，羥基等可解離部分，其極性較大而不適合以經典反相C18類鍵合相進行分離。其典型表現為(wei) 容量因子K過小，導致該類化合物在死時間附近出峰。

對於(yu) 這些極性化合物，雖然我們(men) 可以在做梯度分析方法開發時，選擇降低起始有機相的比例，甚至以純水相作為(wei) 起始流動相來增大該類化合物的容量因子。但化合物色譜峰峰形會(hui) 出現峰展寬以及嚴(yan) 重的C18色譜柱固定相孔內(nei) 去濕現象（Dewetting）；在停泵並重新恢複流速後，會(hui) 出現化合物保留時間減少，色譜峰峰形異常（峰分叉、峰拖尾）等方法重現性問題，尤其以拖尾zui為(wei) 常見。

對於(yu) 這些極性化合物該如何得到較好的保留，在這裏且聽小編慢慢道來。

一 孔內(nei) 去濕現象（Dewetting）

反相HPLC一般以水作為(wei) 弱洗脫相，以甲醇、乙腈等有機試劑作為(wei) 強洗脫相。在運行梯度時，有機相的比例一般可在5%-100%範圍內(nei) 變化，以適應不同樣品的分離需求。對於(yu) 極性化合物來說，在典型的C18色譜柱上，即使有機相比例為(wei) 5%亦不能夠做到有效保留。在進一步降低有機相比例（以至為(wei) 零），就會(hui) 引起色譜柱多孔內(nei) 表麵以及固定鍵合相的去濕現象（Dewetting）。

如圖1A所示，5%及其以上有機相時，流動相可輕易浸入固定相基質多孔內(nei) ，浸濕內(nei) 表麵以及C18烷烴鏈，且C18鏈呈自由伸展構象，可很好的與(yu) 樣品組分的疏水部分發生相互作用實現適當的保留。當使用100%水相的時候，如圖1B，雖然可以選擇增da色譜柱前段壓力的方式，使得純水相浸入基質多孔內(nei) 部，卻無法實現對內(nei) 表麵以及C18鏈的有效浸濕，此外由於(yu) 色譜柱沿流動相流動方向上的壓力降現象（如圖2），使得整個(ge) 色譜柱的浸濕狀態存在很大差異。當柱前壓減小時（如停泵），由於(yu) 多孔內(nei) 部的強疏水性，純水相則被“排出”孔隙，導致去濕現象發生，如圖1C所示

C18鏈在孔內(nei) 去濕現象發生前後，在多孔內(nei) 的構象如下圖3所示。在典型反相HPLC流動相下（水相≤95%），C18鏈在多孔內(nei) 呈現自由伸展構象；在100%水相下， C18鏈則相互之間“交聯”並zui大程度的靠近內(nei) 表麵，形成疏水屏蔽層，失去與(yu) 待分離組分疏水部分相互作用的能力，導致保留時間變短。

二 極性化合物分離挑戰

以典型的反相C18色譜柱對極性化合物進行分離時，往往會(hui) 出現保留時間過短，色譜峰峰形拖尾問題。保留時間過短往往是由於(yu) 化合物本身或者在體(ti) 係中解離之後極性過大，油-水分配係數過小而不能與(yu) 疏水選擇性基團發生足夠的疏水相互作用，進而隨起始流動相一起直接流出色譜柱。

如有機酸類化合物在流動相pH大於(yu) 其pKa時發生解離而本身帶負電，可與(yu) 矽膠基質上殘留的金屬離子發生靜電相互作用；有機堿類化合物在流動相pH小於(yu) 其pKa時發生解離而本身帶正電，與(yu) 弱酸性的矽羥基產(chan) 生靜電相互作用；多羥基，羥基-胺類有機化合物以及未解離有機酸堿類化合物與(yu) 矽羥基之間的氫鍵相互作用。以上三種“二級保留”相互作用，均會(hui) 造成有機極性化合物的拖尾。此外，溶解極性化合物的溶劑選擇不合適的話，也會(hui) 導致色譜峰拖尾現象。典型極性化合物如下圖4所示。

因此，極性化合物在反相色譜柱上做分析方法開發時主要麵臨(lin) 以下幾方麵的問題：

（1）如何使得極性化合物具有適當的保留時間；

（2）如何避免在使用高水比例甚至純水相洗脫時出現的孔內(nei) 去濕（相塌陷）問題；

（3）如何zui大可能地減小色譜峰拖尾因子，獲得優(you) 異的峰形；

三 極性化合物分離策略

利用純水相洗脫方式對極性化合物進行分離，麵臨(lin) 色譜柱固定相孔內(nei) 去濕（相塌陷）問題，但可通過對經典反相C18鍵合相進行改性，或者使用其他鍵合相以及使用Hilic分離模式，zui大程度地減小或避免該現象的發生，同時做到對極性化合物有效保留。

色譜柱孔內(nei) 去濕現象的發生以及程度的大小與(yu) 色譜填料顆粒孔徑的大小，多孔內(nei) 表麵鍵合相的鍵合密度，所用烷烴鏈長度、基質表麵裸露的矽羥基數量以及封端類型有關(guan) 。

3.1 非封端短鏈烷烴鍵合固定相

這種類型的反相色譜柱主要特點有兩(liang) 個(ge) ：矽膠基質表麵裸露的矽羥基不封端以及鍵合固定相鏈長度小於(yu) C8。由於(yu) 固定相烷烴鏈長度遠小於(yu) C18，多孔內(nei) 疏水性變小，加之表麵矽羥基不封端使得純水相與(yu) 多孔接觸角變小，與(yu) 典型C18相比，發生孔內(nei) 去濕現象的可能性大大減小。與(yu) 此同時，該種類型的色譜柱由於(yu) 鍵合烷烴鏈長度較小，在對樣品組分分離的時候，吸附作用以及矽羥基氫鍵相互作用占主要地位。例如月旭Ultimate®XB-C1。

3.2 極性封端與(yu) 極性增強型固定相

該型色譜柱采用極性或者親(qin) 水性的封端試劑對表麵裸露的矽羥基進行封端，C18的鍵合密度較低，這種改性方式與(yu) 典型的C18色譜柱相比，增大了內(nei) 表麵的水浸潤性且較低的鍵合密度也使得孔內(nei) 疏水性相對減小，因而允許使用100%水相。例如月旭Ultimate®ALK-C18。

3.3 極性內(nei) 嵌烷基固定相

這種類型的色譜柱在長鏈烷基靠近矽膠內(nei) 表麵的一端，內(nei) 嵌入甲酸酯基類、脲或者酰胺基以及硫酰胺基等極性改性官能團。由於(yu) 極性內(nei) 嵌，使得整個(ge) 鍵合相的親(qin) 水性增強，多孔內(nei) 疏水性減小，在100%水相條件下，極性內(nei) 嵌烷烴鏈依然保持自由伸展構象。此外，內(nei) 嵌極性基團對表麵裸露的矽羥基亦有一定的屏蔽作用，減小了極性化合物特別是堿性化合物的拖尾因子，色譜峰峰形更加對稱。例如月旭Ultimate®Polar-RP。

四 常用耐100%水相色譜柱

月旭常用的耐100%水相的反相色譜柱有：

典型反相HPLC色譜柱在使用100%水相對極性化合物進行分離分析時，易出現矽膠多孔內(nei) 去濕（相塌陷）現象，導致化合物保留時間減小，方法重現性出現問題。通過對色譜柱矽膠表麵或者烷烴鏈改性，如增加內(nei) 表麵極性大小以及烷烴鏈內(nei) 嵌極性官能團，使得多孔內(nei) 表麵及固定相被水浸潤能力增加，而減少或避免孔內(nei) 去濕現象的發生。此外，也可通過調整HPLC操作方式以及改變色譜條件，對極性化合物的保留因子以及峰形進行調整。