敲黑板！！！His標簽融合蛋白純化常見問題和解決方案全收納

His標簽融合蛋白的純化是借助於(yu) 層析介質上的過渡金屬離子（如Cu2+、Zn2+、Ni2+、Co2+等）與(yu) His融合蛋白上的His標簽的配位作用實現目標蛋白的分離。組氨酸（His）的殘基上帶有1個(ge) 咪唑基團，可以和Ni2+等過渡金屬離子形成配位鍵而選擇性的結合在金屬離子上，這些金屬離子通過螯合配體(ti) 固定在層析介質上，因此帶有His標簽的蛋白可以特異性的吸附在螯合了Ni2+等過渡金屬離子的層析介質上，而其他不含His標簽的雜質蛋白則不能吸附或僅(jin) 微弱吸附在介質上。通過提高緩衝(chong) 液中的咪唑濃度進行競爭(zheng) 性洗脫，可以將His標簽融合蛋白從(cong) 層析介質上解吸附下來，從(cong) 而得到較高純度的目標蛋白。

常用的His標簽融合蛋白純化的填料有Ni Tanrose 6FF（NTA/IDA）金屬螯合親(qin) 和填料，但是在使用過程這種常常會(hui) 出現一些問題，這裏就給各位老師介紹下常見問題和解決(jue) 方案

填料清洗

當填料使用過程中發現反壓過高或者填料上麵出現明顯的汙染時，需要進行在位清洗操作 （Cleaning-in-Place，CIP）。

建議按照下麵操作去除填料上殘留的汙染物，如沉澱蛋白、疏水蛋白和脂蛋白等。

去除強疏水結合的蛋白，脂蛋白和脂類

通過使用 30%異丙醇清洗 5-10 個(ge) 柱體(ti) 積，接觸時間為(wei) 15-20 分鍾可以去除此類汙染物。然後，再使用 10 倍柱體(ti) 積的去離子水清洗。也可以選擇使用含有去汙劑的酸性或堿性溶液， 清洗填料 2 倍柱體(ti) 積。例如，含有 0.1–0.5% 非離子去汙劑的 0.1 M 醋酸溶液，接觸時間 為(wei) 1–2 小時。去汙劑處理後，需要使用 70%的乙醇清洗 5 個(ge) 柱體(ti) 積，以*去除去汙劑。後使用 10 倍柱體(ti) 積的去離子水清洗。

去除離子作用結合的蛋白

使用 1.5M NaCl 溶液接觸時間為(wei) 10-15 分鍾清洗。然後，再使用去離子水清洗 10 個(ge) 柱體(ti) 積。

填料再生

組氨酸標簽蛋白親(qin) 和純化填料所帶的鎳離子不需要經常螯合去除和重新掛鎳離子。當填料使 用過程中發現顏色變淺，或者填料載量明顯變低時，需要進行對填料進行鎳離子剝離和重新 掛鎳離子，也就是填料再生。將填料裝填在合適的層析柱內(nei) ，按照下麵操作流程進行鎳離子 剝離和重新掛鎳離子。

1) 使用 0.2 M 醋酸溶液（含 6 M GuHCl）清洗 2 倍柱體(ti) 積；

2) 使用去離子水清洗 5 倍柱體(ti) 積；

3) 使用 2% SDS 清洗 3 倍柱體(ti) 積；

4) 使用去離子水清洗 5 倍柱體(ti) 積；

5) 使用乙醇清洗 5 倍柱體(ti) 積；

6) 使用去離子水清洗 5 倍柱體(ti) 積；

7) 使用 100 mM EDTA (pH 8.0)清洗 5 倍柱體(ti) 積；

8) 使用去離子水清洗 5 倍柱體(ti) 積；

9) 使用 100 mM NiSO4 清洗 5 倍柱體(ti) 積；

10) 使用去離子水清洗 10 倍柱體(ti) 積；填料再生後，可以立即使用，也可以保存在 20%的乙醇中，置於(yu) 4°C 保存。