【方法優化】食品中酸性橙II前處理優化思路

非食用著色劑酸性橙Ⅱ，Acid Orange 7，染料索引號：C.I. 15510，是一種常用的工業(ye) 染料，有強致癌性。因其色澤鮮豔、勻染性好、價(jia) 格低廉等特點，酸性橙Ⅱ常被不法商家偷偷使用於(yu) 食品生產(chan) 加工，因而酸性橙Ⅱ被列入食品中禁用著色劑的檢測範圍。目前，國家已經發布3個(ge) 推薦性的食品中酸性橙Ⅱ專(zhuan) 用檢測標準，但由於(yu) 不同實驗室間儀(yi) 器、人員、實驗耗材、樣品等條件存在差異，*執行方法就能達到回收率、精密度要求的情況很少。因此，根據實際情況進行方法的優(you) 化是必要的。

近，小編在用不同的基質按照標準《SN/T 3536-2013 出口食品中酸性橙Ⅱ號的檢測方法》做酸性橙Ⅱ回收實驗時，發現回收率不很理想，而且6.1.2所規定的固態樣品前處理方法非常耗時（特別是淨化前提取液需“濃縮約至10mL”這一步）。因此小編依據標準方法對不同實驗環節進行了一些優(you) 化，在這裏將全過程分享給各位朋友以供參考交流~

樣品淨化步驟

樣品淨化步驟優(you) 化涉及SPE小柱與(yu) 濾膜的選擇、固相萃取操作步驟。

首先，我們(men) 需要按標準方法進行實驗，驗證所用SPE小柱與(yu) 濾膜是否滿足當下實驗條件需求：

1. 根據標準3.6節（見下圖）選擇對應的SPE小柱。

由此，小編選擇了月旭Welchrom® NH2小柱（500mg/6ml,30pk，貨號：00509-11006）。

2. 使用酸性橙Ⅱ標準溶液，按標準6.1.3節的淨化方法（見下圖）進行固相萃取操作（小柱的活化方法見3.6），留取每一操作步驟的樣液用於(yu) 上機檢測。

在這裏，小編移取0.1mL 10mg/L酸性橙Ⅱ標準溶液，加10mL水混勻作為(wei) 上樣溶液,並根據6.1.3分別收集上樣液、淋洗液、洗脫液、二次洗脫液進行上機檢測（此方法又稱“分步留樣”，是分析SPE操作過程中影響回收率的環節及原因的常用方法）。

3. 選擇合適的濾膜過濾樣液，上機檢測。

根據6.1.3，樣液上機前要過膜淨化。我們(men) 都知道，濾膜作用是淨化樣液，防止雜質汙染色譜柱。但使用濾膜（或使用不合適的濾膜）可能會(hui) 影響目標物的回收率甚至引入雜峰。因此，小編嚐試了三種過膜方式：1) 不過膜；2) 水係濾膜；3) Nylon濾膜。

藍色為(wei) 樣液不過膜，峰麵積12.0191

粉色為(wei) 樣液過水係濾膜，峰麵積11.4695

黑色為(wei) 樣液過Nylon濾膜，峰麵積6.4975

結果發現過膜後，過膜樣液的圖譜峰麵積：過Nylon濾膜＜過水係濾膜＜不過膜，說明過水係膜或有機係膜都對目標物造成一定損失。因此後續實驗的樣液均不過膜上機。建議本實驗樣液上機前不過膜。

後，小編發現上樣液、淋洗液以及兩(liang) 次的洗脫液中都沒有目標物酸性橙Ⅱ檢出，酸性橙Ⅱ終的回收率已經達到了95%-105%，滿足了檢測的要求。

樣品提取步驟優(you) 化

其次，按照標準方法小編進行了空白基質加標實驗，驗證樣品提取步驟是否影響不同基質樣品中目標物的回收。實驗方法如下圖所示。

實驗過程中，小編發現：

6.1.2 固態試樣提取方法中提及：要用20mL乙醇-氨溶液（配製方法見3.4）提取2遍，再合並提取液，濃縮至10mL。

此時洗脫液總量約40mL，需40℃濃縮至10mL左右【相當於(yu) 除去乙醇】。整個(ge) 濃縮過程非常耗時，差不多處理一個(ge) 樣要一小時，而且終的結果回收率非常不理想。

按照第yi次實驗的結果，小編進行了一些優(you) 化，標準上是全部提取液濃縮至10mL左右後淨化，改為(wei) 移取了其中20mL經濃縮至約5mL後上樣。

根據第二次實驗結果，回收率已經達到了90%-100%，滿足了檢測的要求。

終優(you) 化後的實驗步驟和譜圖

一、提取

稱取樣品2g（±0.01g）於(yu) 50mL離心管中，加入20mL乙醇-氨溶液，超聲提取30min，離心10min（4000r/min），吸取上清液於(yu) 另一50mL離心管中；殘渣中加入20mL乙醇-氨溶液，重複提取一次，合並兩(liang) 次上清液，混勻，準確移取20mL上清液，40℃旋轉蒸發至少於(yu) 5mL,轉移至15mL離心管中，用水定容至10mL，待淨化。

二、淨化

SPE柱：月旭Welchrom® NH2規格：500 mg/6mL

活化：依次用5mL甲醇，5mL2%甲酸水溶液過柱，棄去流出液

上樣：將待淨化液全部上樣，自然流幹，棄去流出液

淋洗：依次用5mL2%甲酸水溶液，再用5mL甲醇淋洗小柱，棄去流出液

洗脫：用5mL10%氨水甲醇溶液，收集於(yu) 15mL試管中，抽幹小柱

濃縮：氮吹至近幹，用水定容至1mL,上HPLC檢測。

三、儀(yi) 器條件

色譜柱：月旭Ultimate®XB-C18,4.6×250mm,5μm

流動相：乙酸銨：甲醇=35:65

柱溫：35℃

進樣量：20μL
檢測波長：484nm

流速：1.0mL/min

總結

在優(you) 化標準方法的時候：

1）先選擇合適的SPE小柱，用目標物標準溶液進行固相萃取操作，分步排查SPE步驟，確認小柱與(yu) 標準方法是否滿足具體(ti) 要求；

2）再按標準方法，做空白基質加標，確認前處理樣品提取步驟中目標物的損失情況，分析造成目標物損失的原因及步驟，有針對性優(you) 化方法；

3）接著做樣品和樣加標，看目標物回收率情況，優(you) 化提取量或提取次數；後得出一個(ge) 穩定的方法，保證滿足標準回收率要求進行檢測。