簡略質量研究案例（四）

在整個(ge) 質量標準的各項檢查中，有關(guan) 物質項占據了大半“江山”，同時，在整個(ge) 質量研究的分析方法研究過程當中，有關(guan) 物質項也占據了很大的一部分精力。在快的時間內(nei) 設計或者選擇一個(ge) “穩健”的有關(guan) 物質方法，成為(wei) 項目完成與(yu) 否的關(guan) 鍵。

對於(yu) 暫未有藥典收載的藥物，通常會(hui) 從(cong) 整個(ge) 雜質譜的結構分析開始。對於(yu) 結構的分析，又要往前翻到本係列的篇簡略質量研究案例（一）點擊藍字回看，根據文中所述，去各網站或者數據庫中查詢並歸納各個(ge) 雜質的性質，根據性質來選擇波長、色譜柱、流動相等。對於(yu) 波長的選擇，在有關(guan) 物質方法的檢查中，與(yu) 含量中波長的選擇依據有差異。對於(yu) 含量分析方法來說，更關(guan) 心的是主成分的吸收，而對於(yu) 有關(guan) 物質分析來說，更關(guan) 心的是各個(ge) 雜質的穩定檢出。雜質限度較低，波長選擇的差異容易影響到各個(ge) 雜質的限度。而流動相和固定相（色譜柱）等色譜條件的選擇，則會(hui) 影響到方法的穩健性。一個(ge) 穩健的分析方法，會(hui) 讓我們(men) 的分析方法驗證、分析方法轉移等工作更加順暢。一個(ge) 耐用性較差的方法，不止會(hui) 在整個(ge) 研究過程當中虐得我們(men) si去活來，還會(hui) 影響研究數據的準確性。

當然，對於(yu) 我們(men) 今天所需要討論的氟呱啶醇有關(guan) 物質檢查項來說，因為(wei) 已有各國藥典收載，故一般還是從(cong) 藥典方法開始進行篩選。

目前，中國藥典、美國藥典、歐洲藥典、英國藥典及日本藥典均收載了其有關(guan) 物質檢查分析方法，各藥典對比如下：

對比四國藥典，均采用C18的色譜柱，EP還特別標注了堿去活封尾色譜柱。從(cong) 本係列的節開始，我們(men) 就知道，氟呱啶醇是一個(ge) 弱堿。在我們(men) 接觸液相色譜開始，相信絕大多數人都知道，矽膠基質的色譜柱，容易封尾不*而存在一些弱酸性的矽羥基活性位點（Si-OH），這些活性位點會(hui) 增強對離子化後的堿性化合物的保留而造成拖尾。當然，堿性化合物的拖尾不止這一點，還包括過載引起的拖尾。對於(yu) 液相色譜拖尾問題，小編在本公眾(zhong) 號之前的一個(ge) 係列中有詳細闡述。（奉送直達車：峰型那些事（一））。除中國藥典未標注色譜柱規格外，其他三國藥典所用的色譜柱從(cong) 規格上看，柱效基本一致。流動相體(ti) 係的選擇，則是分離策略的選擇。

ChP2015所用的磷酸鹽緩衝(chong) 體(ti) 係，pH剛好在其緩衝(chong) 範圍外，但是，其磷酸鹽濃度較常規使用的高（50mmol/L），應該能彌補這一點，另外，ChP2015的供試品濃度並不高（1mg/ml），也彌補了流動相緩衝(chong) 能力不夠的缺點。但從(cong) 主成分氟呱啶醇來說，再降低一些流動相pH，比如用pH=3.0，可能更加合適。當然，我們(men) 一直所說的，單一個(ge) 組分無所謂方法，對於(yu) 有關(guan) 物質來說，更多的考慮是其他組分，而不單單是主成分。對於(yu) 氟呱啶醇這個(ge) 項目，小編純屬紙上談兵，並未深入，而實際當中具體(ti) 的選擇，還是根據具體(ti) 的工藝來實現。

對於(yu) JP17，其選擇的緩衝(chong) 鹽體(ti) 係剛好在檸檬酸鹽的緩衝(chong) 範圍內(nei) （pKa1=2.1~4.1），但是，其選擇的波長（220nm）又超出了檸檬酸鹽的截止波長（230nm），超出了截止波長就意味著本底有吸收，可能會(hui) 影響定量限的濃度水平。另外，JP17還加入了一個(ge) 小編很不喜歡的離子對-十二烷基硫酸鈉（SDS）。SDS作為(wei) 陽離子對試劑，一方麵可以增加氟呱啶醇的保留，另一方麵，則可以改善峰型。但是SDS的使用存在一些缺陷，市售的SDS質量差異非常大，換個(ge) 品牌或者換個(ge) 批次，會(hui) 發生無法重現方法的問題。這是因為(wei) 市售SDS純度差異較大的以及組成差異的關(guan) 係。以SDS為(wei) 離子對試劑帶來的另一方麵的困擾是方法耐用性較差，使用的過程當中，必須量取流動相的各組分，確保每次配製的流動相比例一致。否則，微小的緩衝(chong) 鹽-有機相比例差異可能會(hui) 造成較大的保留時間差異。

USP40\EP9.0\BP2019方法一致，均為(wei) 緩衝(chong) 液-乙腈體(ti) 係。在常規的使用中，四丁基硫酸氫銨在大多數場合均作為(wei) 離子對試劑出現。但在USP40\EP9.0\BP2019方法中，其並不是作為(wei) 離子對存在。折算下濃度，其在流動相中的濃度也不低（50mmol/L），一方麵，作為(wei) 增加離子強度的緩衝(chong) 鹽，該濃度下溶液的pH應為(wei) 2~3。另一方麵，更重要的，是作為(wei) 與(yu) 待測組分相同的離子組分存在於(yu) 流動相中，形成離子氛，減少氟呱啶醇與(yu) 固定相間的相互作用，減少拖尾。四丁基硫酸氫銨作為(wei) 一個(ge) 陽離子，也能與(yu) 固定相中的活性矽羥基作用，同樣能從(cong) 另一方麵減少拖尾。由此可見USP40\EP9.0\BP2019在多方麵改善了有關(guan) 物質的峰形問題，過載問題（峰形問題），當然，過載後的峰形較差，峰寬較寬，會(hui) 影響主峰附近的雜質峰分離，進而影響各雜質的定量限濃度。由於(yu) 有了上述的一些措施，USP40\EP9.0\BP2019的供試品濃度能使用較高的濃度（10mg/ml），較高的供試品濃度意味著更低的檢出限。

稀釋劑的選擇，氟呱啶醇在分子狀態其疏水性並不低，故USP40\EP9.0\BP2019選擇了純甲醇來作為(wei) 稀釋劑。而ChP2015和JP17的流動相均為(wei) 酸性緩衝(chong) 液和高比例的有機相，且其供試品濃度較低，用流動相作為(wei) 稀釋劑既方便又可以滿足稀釋的能力。

相較於(yu) ChP2015和JP17的等度，USP40\EP9.0\BP2019的梯度方法現階段更易被接受。一般認為(wei) 梯度方法能有更高的區分力和區分範圍，較等度方法更科學合理。

至於(yu) 波長及流速的選擇，不同的流動相體(ti) 係也會(hui) 影響UV曲線的表現以及組分的保留情況，至於(yu) 如何選擇，跟所需分離的有關(guan) 物質有關(guan) 。綜合考慮，選擇you的組合。

至於(yu) 供試品濃度及進樣量，前述段落中已有所表述。

至於(yu) 計算方式是選擇外標法還是主成分自身對照法，亦或是主成分外標法，還是主成分外標/自身稀釋對照外標加校正因子法，取決(jue) 於(yu) 產(chan) 品的特性，從(cong) 成本角度，方便角度，科學合理角度綜合考慮，選擇即合理又方便的方式。

限度的考察，條即來自於(yu) ICH的限度要求。根據每日大劑量，推算產(chan) 品的單雜限度。對於(yu) 藥典中已列明的已知雜質，可參照藥典標準進行修訂。終定入質量標準的雜質並不是越多越好。越多的雜質表明後續測試愈加繁瑣，而我們(men) 的目標，是在盡量少的操作中，控製風險，使得產(chan) 品更加安全可靠。

有沒有小夥(huo) 伴要問小編：難道USP40\EP9.0\BP2019就*了嗎？USP40\EP9.0\BP2019所使用的四丁基硫酸氫銨會(hui) 吸附在色譜柱上，可能會(hui) 使該色譜柱改性而不便於(yu) 其他產(chan) 品的使用。另外，四丁基硫酸氫銨的使用，可能會(hui) 減少色譜柱的壽命。對的，成本的增加也是方法的缺陷哦！~我記得在前述的某篇文章中曾提到，沒有的方法，隻有適合的方法。

ChP2015及JP17，在限度以及各方麵均能滿足的情況下，也算一個(ge) 合適的方法。至於(yu) 如何挑選，一定是綜合各方麵的情況後綜合選擇的。至於(yu) 方法是否在各方麵均能滿足，需要通過分析方法學驗證來確證。分析方法學驗證如何做，且聽下回分解！~